調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞在重癥癥肌無力患者中的變化及免疫抑制劑對它們的影響.pdf

1、重癥肌無力(MG)是一典型的器官特異性自身免疫性疾病,是自身免疫耐受失敗的結(jié)果。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是調(diào)控和維持機體自身免疫耐受的主要免疫細(xì)胞,其中在數(shù)量和功能上起扮演主要角色的是胸腺來源的自然Tregs(nTregs)。Tregs與效應(yīng)T細(xì)胞(Teffs)在機體內(nèi)處于相互依存的關(guān)系,且維持著一定的平衡狀態(tài),自身免疫性疾病的發(fā)生是與這種平衡被先天或后天的因素所破壞有關(guān)。近年來,關(guān)于Tregs在MG發(fā)病中的作用備受

2、國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注,但研究得出的結(jié)論并非完全一致,可能涉及的因素包括選取不同的Tregs相關(guān)分子、年齡偏差等。因此,我們認(rèn)為在全面系統(tǒng)評估MG患者體內(nèi)Tregs和Teffs的變化時需考慮到這些混雜因素的干擾。此外,我們也想了解那些常規(guī)治療MG患者的免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素(GC)和丙種球蛋白(Ig)是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的。
　　本研究分為三個部分:一、檢測MG患者外周血中代表Tregs的相關(guān)分子,探索它們與患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性以及

3、GC等免疫抑制劑對它們影響。二、了解Tregs、naveT細(xì)胞和Th17細(xì)胞在MG患者胸腺組織中的表達(dá)情況。三、觀察Th1/Th2/Th17等Th亞群在MG患者外周血中的變化以及GC等免疫抑制劑對它們的影響。
　　一、MG患者外周血中Tregs相關(guān)分子的變化以及強的松等免疫抑制劑對它們的影響
　　CD4+FOXP3+T細(xì)胞、CD4+CD25highT細(xì)胞、CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3+T

4、細(xì)胞均被不同的研究者看做是人源Tregs的代表,在本次研究中我們一一考察它們在MG患者外周血中的變化,并探索它們與患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性以及GC等免疫抑制劑對它們影響。
　　本實驗我們采用流式細(xì)胞儀的六色熒光分析技術(shù)。為了解Tregs對患者病情的影響,將65例MG患者分為活動期患者57例和緩解期患者8例。為探討GC、Ig等免疫抑制劑對Tregs和Th亞群的影響,我們又將活動期的57例MG患者分為未治療組17例、GC治療組29例和

5、IVIg治療組11例。健康對照組90例?；颊呓M平均年齡是39.0±13.2歲,健康對照組平均年齡34.5±9.0歲?；颊呓M性別比是11:8(男:女),健康對照組是3:2(男:女)。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)外周血中CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞的比例和絕對數(shù)無論在活動狀態(tài)的患者還是處于緩解期的患者與健康對照者相比均無明顯差異。我們對CD4+CD25highT細(xì)胞的檢測結(jié)果顯示活動期患者CD4+CD25highT細(xì)胞比例顯著低于健康對照

6、者,與緩解期患者相比較時卻無差異。
　　CD4+FOXP3+T細(xì)胞在未治療組和GC治療組與健康對照組比較時均未見差異,但I(xiàn)VIg治療組的百分比顯著升高。CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞無論在百分比和絕對數(shù)上活動期患者顯著地低于緩解期患者和健康對照者,后兩者之間則無差異。在應(yīng)用GC和Ig等免疫抑制劑后多數(shù)患者肌無力癥狀得到了不同程度的改善,伴隨的是患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞比例的升高,它們之間呈顯著的負(fù)相關(guān)

7、。
　　二、Tregs、na?veT細(xì)胞和Th17細(xì)胞在MG患者胸腺組織中的變化
　　為探討胸腺在MG發(fā)病中的價值,我們進(jìn)行了胸腺標(biāo)本的免疫組化分析。為防止年齡等混雜因素對結(jié)果的影響,我們還同時設(shè)立了多組對照,包括健康對照組和MG(-)的胸腺瘤組。健康對照來自因胸部外傷或心血管畸形接受心臟手術(shù)的患者,他們既往均未罹患自身免疫性疾病,也未服用相關(guān)藥物。MG患者組39例,平均年齡40.92±14.4歲,男女性別比是10:29;健

8、康對照組14例,平均年齡14.43±6.28歲,男女性別比是3:11;MG(-)的胸腺瘤患者組29例,平均年齡45.24±12.70歲,男女性別比是8:21。CD25在胸腺中的表達(dá)強烈提示是Tregs,而FOXP3的表達(dá)又是決定胸腺產(chǎn)生的Tregs是否成熟及能否發(fā)揮抑制功能的關(guān)鍵,因此,我們同時檢測了CD25和FOXP3在胸腺中的表達(dá)情況作為胸腺Tregs的代表
　　結(jié)果：顯示MG患者胸腺中CD25陽性細(xì)胞和FOXP3陽性細(xì)胞的數(shù)

9、量和表達(dá)強度顯著低于健康對照組,但兩者存在著年齡的偏差,因此差異可能是由年齡造成的。因此,我們又將年齡與MG患者匹配的MG(-)的胸腺瘤患者與之相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論在數(shù)量還是強度上兩者均無明顯差異。
　　與Tregs相對應(yīng)的Teffs前體naiveT細(xì)胞是在胸腺中發(fā)育并輸出的,我們的免疫組化結(jié)果同時顯示MG(+)胸腺瘤患者胸腺中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞較MG(-)胸腺瘤患者和健康對照者顯著增多。
　　我們用流式的方法檢測了

10、幾例新鮮胸腺標(biāo)本中Th17細(xì)胞的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是MG(+)的胸腺瘤患者還是MG(-)胸腺瘤患者胸腺中均未發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞,同樣在健康對照者胸腺中也未發(fā)現(xiàn)。
　　三、Th1/Th2/Th17等Th細(xì)胞亞群在MG患者外周血中的變化及免疫抑制劑對它們的影響
　　Th細(xì)胞的不同亞群在MG發(fā)病中扮演什么樣的角色是我們此次研究的目標(biāo)之一。我們將新鮮提取的外周血單個核細(xì)胞(PBMNC)在加入適當(dāng)濃度的刺激劑后放置CO2孵育箱培養(yǎng)4～6

11、個小時。然后進(jìn)行流式抗體標(biāo)記?？紤]到CD4+T細(xì)胞在增殖過程中可能會出現(xiàn)包膜內(nèi)陷CD4分子難以檢測到,我們采用CD3和CD8抗體反相標(biāo)記CD4+T細(xì)胞。Th亞群的代表性細(xì)胞因子均為胞內(nèi)表達(dá),故在標(biāo)記表面分子后須固定、破膜。Th亞群的流式檢測結(jié)果顯示患者外周血中的Th1/Th2/Th17無論在比例和絕對數(shù)上均與健康對照者無明顯差異,GC和Ig等免疫抑制劑對它們也無明顯的影響。與此相對應(yīng)的是,MG患者血漿中分別代表不同Th亞群的炎癥細(xì)胞因子

12、與健康對照者相比較也無明顯不同。
　　總之:根據(jù)我們的研究結(jié)果可以得出這樣的幾個結(jié)論:
　　1)在免疫穩(wěn)態(tài)中具有最強的免疫調(diào)節(jié)功能也是nTregs中一個最穩(wěn)定的亞群CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞在MG患者外周循環(huán)中顯著減少,可能的原因并不是胸腺發(fā)育的缺陷。另外,我們在研究中發(fā)現(xiàn)患者外周循環(huán)中CD4+FOXP3+T細(xì)胞百分比和絕對數(shù)與健康對照者比較均沒有明顯減少。
　　2)患者外周血中的三個Th亞群無論是絕對數(shù)還是