Survivin在BCR-ABL轉(zhuǎn)化白血病細胞中的表達調(diào)控、作用與治療策略的研究.pdf

1、背景：BCR/ABL可組成性激活多種不同的信號途徑，形成了一個非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在很大程度上，這些信號最終傳遞至細胞核內(nèi)并調(diào)控凋亡和生存相關(guān)基因的表達，從而延緩白血病細胞的凋亡，促進細胞存活，維持惡性細胞和克隆在體內(nèi)長期存活和聚積。Survivin是一個凋亡抑制因子家族(IAP)成員，在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著多重效應(yīng)，是腫瘤細胞凋亡和分裂的界面分子，并參與基因組復(fù)制檢測點的監(jiān)測和腫瘤的血管新生，因而成為腫瘤治療的一個理想靶點。最近，有

2、研究表明BCR/ABL能夠激活survivin的表達，并提示survivin可能是CML發(fā)展過程中一個重要的分子。然而，關(guān)于survivin在CML細胞中的具體調(diào)控機制和生物學(xué)作用還不清楚。 目的：以BCR/ABL轉(zhuǎn)化的造血細胞系為研究模型，系統(tǒng)探討survivin表達調(diào)控的信號途徑和分子機理，以及這一信號網(wǎng)絡(luò)在BCR/ABL介導(dǎo)的細胞惡性轉(zhuǎn)化和抗凋亡調(diào)控中的作用，與此同時尋找其中關(guān)鍵分子作為靶點，觀察其在抗白血病治療中的效應(yīng)。

3、 方法：半定量PCR、Westernblot、免疫熒光、流式細胞儀技術(shù)比較BCR/ABL轉(zhuǎn)化細胞和對照細胞中survivin的表達和細胞內(nèi)定位?？寺『蜆?gòu)建survivin啟動子與螢光素酶基因融合的報告載體，使用缺失突變和定點突變的方法鑒定survivin啟動子上BCR/ABL相關(guān)的作用元件。凝膠電泳遷移試驗(EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)技術(shù)分別在體外和活細胞水平上證實c-Myc與survivin啟動子的結(jié)合作用。We

4、sternblot分析CML細胞中c-Myc和survivin表達的相關(guān)性。應(yīng)用MAPK、P13K、JAK2的特異性阻斷劑進一步闡明c-Myc介導(dǎo)的survivin表達的相關(guān)信號途徑。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達技術(shù)以及shRNA干擾技術(shù)，闡明c-Myc和survivin在BCR/ABL介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化和抗凋亡中的作用。最后，應(yīng)用c-Myc特異性阻斷劑-10058-F4，觀察其單獨應(yīng)用和聯(lián)合伊馬替尼對CML細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，以及對

5、BCR/ABL激酶依賴和非依賴的伊馬替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果：BCR/ABL轉(zhuǎn)化的細胞系中survivin表達顯著升高，伊馬替尼能夠抑制其表達并主要影響其在細胞漿的分布。BCR/ABL對survivin表達的調(diào)控不依賴于細胞周期和mRNA的穩(wěn)定性，主要作用于其轉(zhuǎn)錄水平上。BCR/ABL通過JAK2和P13K交聯(lián)的信號途徑激活c-Myc的表達和活性，后者與survivin啟動子上的E-box元件結(jié)合，從而增強survivin在C

6、ML細胞中的表達。并且survivin與c-Myc的表達呈一定的相關(guān)性。Survivin表達與伊馬替尼誘導(dǎo)的細胞凋亡之間存在著動力學(xué)的關(guān)系，其表達下調(diào)是CML細胞凋亡的一個早期事件，survivin過表達能部分抵抗伊馬替尼和去除細胞因子引起的細胞凋亡效應(yīng)。shRNA干擾c-Myc和survivin表達顯著抑制K562細胞在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中的克隆形成能力。10058-F4抑制c-Myc活性并能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，具有與伊馬替尼協(xié)同效應(yīng)

7、。此外，細胞因子I-一3能以BCR/ABL激酶非依賴的機制誘導(dǎo)CML細胞對伊馬替尼的耐受，而10058-F4能夠抵抗IL-3的抗凋亡作用。同時，10058-F4還能增強BCR/ABL依賴的耐藥細胞K562/G01對伊馬替尼的敏感性。 結(jié)論：JAK2/P13K介導(dǎo)和c-Myc依賴的survivin表達是BCR/ABL下游分子信號網(wǎng)絡(luò)的一條新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，并參與對細胞轉(zhuǎn)化和凋亡的調(diào)節(jié)，抑制此通路中的關(guān)鍵分子節(jié)點可作為慢性髓細胞白血