新型藥物載體LyP-1-MWNTs應(yīng)用于胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:設(shè)計(jì)、制備用于胰腺癌淋巴靶向化療的新型載體:LyP-1-MWNTs，分析該載體的理化特性;并通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，研究其攜載吉西他濱(GEM)后靶向治療胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的效果和機(jī)制。
　　方法:
　　(1)實(shí)驗(yàn)采用Fmoc/tbu固相多肽合成技術(shù)合成LyP-1多肽，使用5-FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜法(MS)對(duì)其進(jìn)行表征。采用混酸處理法制備截短的羧基化MWNTs(Cut-MWNTs)，通過氨基

2、與羧基的縮合反應(yīng)共價(jià)枝接Maleimide-PEG-NH2，再通過巰基和馬來酰亞胺的特異性反應(yīng)及碘氧化的方法制備LyP-1-MWNTs復(fù)合載體(LyP-1-conjugated Multi-walled CarbonNanotubes)，觀察該復(fù)合載體在水中的分散性和穩(wěn)定性，并利用熱重分析(TGA)、透射電鏡(TEM)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行表征。
　　(2)以5-FAM組、LyP-1預(yù)處理組為對(duì)照，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察人胰腺癌細(xì)胞

3、株BxPC-3、淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移特性人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3-LN5對(duì)5-FAM標(biāo)記的LyP-1多肽的體外靶向攝取差異。通過MTT法檢測(cè)不同濃度和不同時(shí)間條件下，復(fù)合載體LyP-1-MWNTs攜載吉西他濱(GEM)后對(duì)BxPC-3-LN5細(xì)胞生長的體外抑制作用，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布、增殖指數(shù)和凋亡率。
　　(3)構(gòu)建裸鼠胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈、足墊下注射不同給藥途徑，采用免疫熒光染色法觀察5-FAM-LyP-1、

4、5-FAM-LyP-1-MWNTs對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管的靶向親和性。觀察不同處理組裸鼠腫瘤接種側(cè)腘窩、腹股溝、髂動(dòng)脈旁、腎門淋巴結(jié)黑染情況，結(jié)合淋巴結(jié)病理切片(HE染色)，評(píng)估LyP-1-MWNTs的淋巴示蹤性。通過比較各組腘窩淋巴結(jié)體積、重量的差異，檢測(cè)LyP-1-MWNTs-GEM對(duì)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的體內(nèi)抑瘤效應(yīng);采用EnVision法以及TUNEL法檢測(cè)腘窩淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。檢測(cè)不同處理組裸鼠血常規(guī)、肝功能、腎功

5、能等指標(biāo)，并取裸鼠心、肝、脾、肺、腎等重要器官行HE染色觀察組織損傷情況，探討復(fù)合載體LyP-1-MWNTs的毒副作用。
　　結(jié)果:
　　(1) LyP-1-MWNTs合成制備:原始碳納米管經(jīng)過混酸處理完成羧基化修飾并被截短，TEM表征顯示Cut-MWNTs依舊保持清晰的管狀結(jié)構(gòu)，長度100～200nm，直徑30～40nm;相比原始碳管，其水中的分散性和穩(wěn)定性明顯提高，室溫下靜置3個(gè)月也無沉淀發(fā)生。采用Fmoc/tbu固相合

6、成技術(shù)制備的LyP-1、5-FAM-LyP-1多肽，通過MS表征其分子量得知多肽已成功制備，經(jīng)過純化后HPLC測(cè)試多肽純度均達(dá)到98％以上;LyP-1與Cut-MWNTs通過Maleimide-PEG-NH2完成共價(jià)枝接得到復(fù)合載體LyP-1-MWNTs，TGA分析顯示聚合物的枝接率可達(dá)10.2％，TEM觀察到LyP-1-MWNTs表面有聚合物包裹，故發(fā)生輕度纏繞，但是與Cut-MWNTs相比，并未影響其水中分散性和穩(wěn)定性。
　　

7、(2) LyP-1-MWNTs的體外靶向作用:人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移特性人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3-LN5對(duì)5-FAM標(biāo)記的LyP-1多肽均具有極高的體外靶向攝取，但差異不明顯，且給予游離LyP-1預(yù)處理后，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜表面的LyP-1特異性受體而使5-FAM-LyP-1攝取量明顯下降。
　　空白MWNTs載體對(duì)細(xì)胞增殖抑制率輕微，生物相容性好;MWNTs對(duì)GEM的物理吸附載藥并未出現(xiàn)藥效的減損，甚至體外抗

8、腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)優(yōu)于GEM單藥(P＜0.05); LyP-1多肽發(fā)揮主動(dòng)靶向效能，具有一定的時(shí)間和濃度依賴性，體現(xiàn)在較高藥物濃度水平、相對(duì)較長時(shí)間點(diǎn)時(shí)，出現(xiàn)較MWNTs-GEM、GEM更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，使細(xì)胞大量阻滯于G0/G1期，明顯抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　(3) LyP-1-MWNTs的體內(nèi)靶向作用:選取淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移特性人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3-LN5，采用爪墊皮下注射法構(gòu)建裸鼠胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)種瘤側(cè)腘窩

9、、髂動(dòng)脈旁及雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移;5-FAM-LyP-1（尾靜脈注射）、5-FAM-LyP-1-MWNTs（爪墊下注射）給藥后，所含LyP-1均能與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中腫瘤淋巴管發(fā)生特異性結(jié)合;LyP-1-MWNTs對(duì)淋巴結(jié)的示蹤性優(yōu)于MWNTs，其引流途徑上的腘窩、腹股溝、髂動(dòng)脈旁、腎門淋巴結(jié)均出現(xiàn)明顯黑染，顯微鏡下可見大量黑色碳管顆粒聚集于腫瘤轉(zhuǎn)移灶周圍。
　　LyP-1-MNTs-GEM的體內(nèi)靶向抗淋巴轉(zhuǎn)移灶療效顯著優(yōu)于GE

10、M與MWNTs-GEM，該組腘窩淋巴結(jié)體積最小、腫瘤細(xì)胞免疫組化陽性指數(shù)最低、凋亡指數(shù)(AI)最高(P＜0.05);含MWNTs各組裸鼠爪墊注射部位皮膚有黑染，但是裸鼠健康狀況良好，體重、血常規(guī)、血生化指標(biāo)與其余各組相比無顯著差異(P＞0.05)，心、肝、脾、肺、腎等重要器官病理學(xué)檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)明顯組織損傷和碳管材料的沉積，提示碳納米管材料具有良好的安全性和生物相容性。
　　結(jié)論:LyP-1-MWNTs是一種新型的靶向藥物載體，具備