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文檔簡介
1、【背景】
胰腺癌惡性程度極高,早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移,易產(chǎn)生抗藥性。臨床患者確診后只有10%~15%可手術(shù)切除,5年生存率也僅為1%~5%。目前的研究表明胰腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移是影響治療和預(yù)后的重要因素之一。有效的預(yù)防和控制胰腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移,在探索胰腺癌的有效治療方法及提高綜合治療效果中有重要的意義。近年來,隨著淋巴管示蹤技術(shù)及淋巴管特異性標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,以及對包括癌細(xì)胞的遷移、侵襲、淋巴管新生、侵入淋巴管等多個(gè)部分組成的腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過程
2、的逐漸明確,腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的研究取得了一定的進(jìn)展。但是,胰腺癌向淋巴轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不清楚,針對性的靶向治療也較少報(bào)道,相關(guān)研究已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
KAI1基因全稱KangAi1基因,是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,其編碼的跨膜蛋白屬于跨膜4超家族(TM4SF)。目前在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的研究顯示,KAI1在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中可發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和運(yùn)動,抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等多種作用,相關(guān)作用機(jī)制的研究也在進(jìn)一步開展。此外,臨
3、床病理研究中還發(fā)現(xiàn),KAI1基因的表達(dá)與多種腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。我們以往的研究也首次在發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了KAI1基因的低表達(dá)。因此,KAI1基因在胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中可能具有重要的調(diào)控作用。
【目的】
探討KAI1基因在胰腺癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用與分子機(jī)制。
【方法】
1.采用真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KAI1基因,并通過Western-Blot技術(shù)驗(yàn)證,構(gòu)建高表達(dá)KAI1基因的人胰腺癌MIAP
4、aCa-2細(xì)胞系;2.通過MTT檢測KAI1對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響;3.借助劃痕實(shí)驗(yàn)和TransWell小室觀察KAI1高表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞遷移能力的變化;4.通過Western-Blot技術(shù)檢測KAI1對遷移相關(guān)因子蛋白表達(dá)的調(diào)控;5.建立人胰腺癌皮下成瘤動物模型,觀察KAI1對胰腺癌腫瘤生長及淋巴轉(zhuǎn)移的作用;6.通過免疫組化技術(shù)檢測不同瘤體組織中淋巴管特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-1,計(jì)算微淋巴管密度;7.采用Westernblot及ELIS
5、A技術(shù)檢測KAI1對胰腺癌細(xì)胞淋巴管生成因子的作用;8.采用Westernblot技術(shù)研究KAI1對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
【結(jié)果】
1.經(jīng)G418篩選,利用WesternBlot方法檢測到KAI蛋白表達(dá)明顯增高,成功建立了KAI1高表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞系MIAPaCa-2-K。
2.KAI1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞的增殖無顯著影響。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)KAI1均可抑制胰
6、腺癌細(xì)胞的遷移。Transwell小室實(shí)驗(yàn)中,MIAPaCa-2、MIAPaCa-2-p、MIAPaCa-2-K遷移24小時(shí)后,遷移細(xì)胞數(shù)分別為48±15.4、50±12.4、12±3.8,組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
3.Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對于胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p,MIAPaCa-2-K細(xì)胞中E-粘連素的蛋白表達(dá)增加,而MMP9、MMP2的蛋白表達(dá)水平下降。
4
7、.人胰腺癌裸鼠皮下成瘤發(fā)現(xiàn)MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p組成瘤率為100%,MIAPaCa-2-K組為70%。通過繪制腫瘤體積生長曲線發(fā)現(xiàn)KAI1對裸鼠皮下移植瘤的生長無明顯抑制作用。
5.皮下接種50d后處死裸鼠,獲取瘤體,MIAPaCa-2組重量為1364.40±211.30mg,MIAPaCa-2-p組重量為1426.13±175.10mg,MIAPaCa-2-K組為1294.37±195.40mg,組間無顯
8、著差異(p>0.05)。
6.解剖裸鼠,發(fā)現(xiàn)MIAPaCa-2組8只出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,裸鼠平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)2.47個(gè)/只;MIAPaCa-2-p組7只出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,裸鼠平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)2.14個(gè)/只;MIAPaCa-2-K組3只出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,裸鼠平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)1.33個(gè)/只;組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
7.觀察腫瘤組織中LYVE-1免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),MIAPaCa-2-K組微淋巴管密度為12.2
9、0±3.30,顯著低于MIAPaCa-2組的28.30±5.22和MIAPaCa-2-p組的30.50±4.68,p<0.05。
8.Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對于胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p,MIAPaCa-2-K細(xì)胞中VEGF-A的蛋白表達(dá)無顯著差異,而VEGF-C的蛋白表達(dá)水平明顯下降。ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰腺癌MIAPaCa-2-K細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF-C含量顯著低于MIAPaCa-2和
10、MIAPaCa-2-p細(xì)胞,p<0.05。
9.Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示KAI1基因的高表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞Src及STAT3的磷酸化。分別應(yīng)用Src或STAT3相應(yīng)信號通路阻斷劑均可降低胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2中VEGF-C的蛋白表達(dá)。Src的阻斷劑可以抑制STAT3的磷酸化而STAT3的阻斷劑不能抑制Src的磷酸化。
【結(jié)論】
1.高表達(dá)KAI1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中E-粘連素的蛋白表達(dá),抑制MM
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