奶牛酮體水平與抗氧化、leptin等的關(guān)系及l(fā)eptin等對體外牛肝細胞抗氧化酶表達的影響.pdf

1、酮病是危害高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后健康的最常見疾病之一，研究該病血漿和乳清中酮體水平與leptin、Insulin、氧化/抗氧化的關(guān)系對深入了解該病發(fā)病機理具有重要意義。本實驗測定了乳清抗氧化指標總抗氧化(TAC)，丙二醛(MDA)，過氧化氫酶(CAT)，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)，NEFA(NEFA)和Insulin、leptin、Insulin樣生長因子等內(nèi)分泌因子，按照酮體含量區(qū)分健康牛和酮病牛，分析了乳清中酮體和抗氧化指標的相關(guān)性以及激素

2、的表達量。本研究利用放射免疫分析（Radio Immuno Assay，RIA）和熒光定量PCR技術(shù)以及奶牛肝細胞體外原代分離培養(yǎng)，通過添加不同濃度的leptin、Insulin、Insulin樣生長因子，檢測犢牛肝細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)指標CAT、GPX活性和mRNA表達量、TAC濃度、MDA含量。為了更深入了解奶牛酮病的發(fā)病機理，以便為更好地制定防治措施提供理論依據(jù)。實驗包括
　　實驗一:為了探討荷斯坦奶牛乳汁酮體含量與部分氧化

3、/抗氧化指標水平的相關(guān)性，本研究選擇廣西某奶牛場泌乳早期的荷斯坦奶牛98頭，乳清指標檢測結(jié)果:乳清KET、TAC、MDA、GPX和CAT水平分別為13.8±6.7mg/dl、5.0±3.1U/ml、2.2±1.8 nmol/ml、56.1±47.1U/ml和3.0±2.0U/ml。高乳酮（乳酮≥20 mg/dl，n=18）組奶牛各項指標（除CAT外）的水平均高于中（乳酮10～19.9 mg/dl，n=47）、低乳酮組（乳酮＜10 mg/

4、dl， n=33)的水平，各組KET間存在極顯著差異，中、低乳酮組的TAC間差異顯著。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)全部被檢牛KET與TAC間(r=0.237)、TAC與MDA間（r=-0.233）存在顯著相關(guān)性。高乳酮組MDA與TAC（r=-0.586）、MDA與KET（r=-0.482）存在顯著負相關(guān)(p＜0.05)，對照組(乳酮＜20mg/dl)TAC與KET間存在極顯著正相關(guān)(r=0.298，n=80，p＜0.01)。結(jié)論:研究獲得了奶牛乳清酮

5、體和部分氧化/抗氧化指標的測定值。高乳酮對奶牛乳清氧化/抗氧化指標間的相關(guān)性會產(chǎn)生明顯影響，使TAC與KET相關(guān)性變?nèi)?，使MDA與TAC負相關(guān)性顯著增強，使KET與MDA由顯著的正相關(guān)變?yōu)轱@著負相關(guān)。
　　實驗二:為探討酮病奶牛產(chǎn)后乳清和血漿的leptin，Insulin，NEFA的水平及其關(guān)系，實驗選取健康奶牛7頭和酮病奶牛7頭，自產(chǎn)后第2周開始到7周，每周采集血樣和乳樣，檢測奶牛乳清和血漿的leptin、Insulin和NEF

6、A的水平。結(jié)果表明:酮病牛血漿和乳清leptin，Insulin的水平都降低，而NEFA濃度升高。奶牛乳清NEFA、Insulin、leptin水平顯著比血漿水平高。血漿和乳清水平間均有顯著相關(guān)性，NEFA(n=84，r=0.810，P=0.001), leptin(n=84, r=0.64, P=0.025), Insulin(n=84,r=-0.627，P=0.029)。結(jié)論，發(fā)現(xiàn)了酮病奶牛血漿和乳清leptin，Insulin，N

7、EFA的特征，乳清NEFA的檢測具有替代血漿檢測的可能性。
　　實驗三:本研究通過體外培養(yǎng)犢牛新生肝細胞，測定不同濃度的leptin、Insulin和Insulin樣生長因子對肝細胞中抗氧化關(guān)鍵酶表達量的影響。在細胞培養(yǎng)中添加添加leptin（0、2.5、5、10、50和100 ng/ml）Insulin（0、5、10、20、50和100 nM）;Insulin樣生長因子(0、10、30、50、100和150 ng/ml）培養(yǎng)24

8、 h后，同時在培養(yǎng)液中檢測抗氧化的指標(MDA，TAC，GPX，CAT)前后添加leptin、Insulin和IGFI。結(jié)果表明CAT、GPx、β-actin的SYBRGreenⅠ熒光定量PCR擴增效率均為100％，標準曲線方程和回歸系數(shù)分別為y=-3.315x+14.72，R2=0.9992;y=-3.228x+8.78,R2=0.9998;y=-0.301x+8.9344, R2=0.9997。熒光定量PCR溶解曲線為單一峰，特異性