牛胚胎中抗氧化相關(guān)lncRNA表達分析及細(xì)胞水平功能初探.pdf

1、眾所周知，哺乳動物體外胚胎的發(fā)育率遠遠低于體內(nèi)胚，其妊娠率低和胎兒流產(chǎn)率高均成為牛體外胚胎廣泛應(yīng)用于養(yǎng)牛業(yè)的制約因素，進而影響農(nóng)牧民的收入和我國畜牧業(yè)經(jīng)濟的健康、快速和可持續(xù)發(fā)展。為提高體外胚胎的質(zhì)量，抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)常被用來清除胚胎中的氧自由基，對胚胎發(fā)育有至關(guān)重要的作用。然而，GSH對胚胎整個轉(zhuǎn)錄組水平的影響還不清楚。近年來，隨著長鏈非編碼RNA（lncRNA）的不斷發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控作用也成為研究的熱點

2、和焦點。本文采用單細(xì)胞測序技術(shù)，對GSH處理后的牛體外受精胚胎進行轉(zhuǎn)錄組測序;獲得的lncRNA進行生物信息學(xué)分析，揭示其在早期胚胎抗氧化方面的功能，尋找其中起關(guān)鍵作用的調(diào)控分子或序列。
　　試驗一，通過體外受精方法制備牛胚胎，并培養(yǎng)于含有3 mM GSH的培養(yǎng)液中;分別收集處于8～16-細(xì)胞期和桑椹期的胚胎，以非添加組為對照。每個樣品收集20枚胚胎，并做兩個生物學(xué)重復(fù)。采用HiSeq2000測序平臺，獲得lncRNA序列，并對其

3、進行生物信息學(xué)分析。測序共得到4273個lncRNAs，其中62％來源基因間區(qū);且其在各個染色體的分布沒有明顯的偏好性，說明lncRNAs的轉(zhuǎn)錄是全基因組范圍的。lncRNA的平均表達值、平均長度和平均外顯子個數(shù)都與已知lncRNA一致，證明測序鑒定lncRNA的可靠性。進一步篩選出23個在對照組上調(diào)而處理組下調(diào)的lncRNAs，36個在對照組下調(diào)而處理組上調(diào)的lncRNAs。
　　試驗二，在對照組和處理組中，23個lncRNAs

4、分別與599個和2554個蛋白編碼基因共表達，這些基因分別涉及25個和71個功能分類，且主要參與6條和8條信號通路。36個lncRNAs分別與對照組的483和處理組的609個蛋白質(zhì)編碼基因共表達，分別涉及18個和33個功能分類，主要參與5條和10條信號通路。另外，發(fā)現(xiàn)14個lncRNAs共表達的差異基因參與谷胱甘肽代謝通路。對23個lncRNAs的臨近基因（上下游300 kb）進行GO注釋，發(fā)現(xiàn)其參與35個功能分類;而36個lncRNA

5、s的臨近基因則參與43個功能分類。選取8個lncRNAs進行實時熒光定量PCR，與測序結(jié)果進行Fold Change比較，結(jié)果其中4個在處理組下調(diào)，其余4個則上調(diào)，與測序結(jié)果一致，說明測序結(jié)果的可靠性?？梢?，在體外培養(yǎng)液中添加GSH，對牛早期胚胎的lncRNA表達譜有顯著影響，但其對胚胎發(fā)育的作用及其機制還需要進一步研究。
　　試驗三，建立牛顆粒細(xì)胞細(xì)胞系，經(jīng)過3 mM和5 mM GSH處理后，采用熒光定量PCR檢測4個lncRN

6、As及6個谷胱甘肽合成和代謝相關(guān)基因在其中的表達水平。結(jié)果不同濃度的外源GSH均導(dǎo)致CUFF.152963.1和CUFF.30537.1的表達量顯著下調(diào);5mM GSH則顯著提高顆粒細(xì)胞中CUFF.33095.2的表達水平，而對CUFF.42178.2的表達沒有影響;3 mM GSH卻對CUFF.33095.2和CUFF.42178.2均沒有顯著影響。同時，3mM和5 mM GSH的處理均顯著影響顆粒細(xì)胞中GCLC、GCLM、 GSTA