牛胚胎中抗氧化相關(guān)lncRNA表達(dá)分析及細(xì)胞水平功能初探.pdf

1、眾所周知，哺乳動(dòng)物體外胚胎的發(fā)育率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體內(nèi)胚，其妊娠率低和胎兒流產(chǎn)率高均成為牛體外胚胎廣泛應(yīng)用于養(yǎng)牛業(yè)的制約因素，進(jìn)而影響農(nóng)牧民的收入和我國(guó)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康、快速和可持續(xù)發(fā)展。為提高體外胚胎的質(zhì)量，抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)常被用來(lái)清除胚胎中的氧自由基，對(duì)胚胎發(fā)育有至關(guān)重要的作用。然而，GSH對(duì)胚胎整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平的影響還不清楚。近年來(lái)，隨著長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）的不斷發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控作用也成為研究的熱點(diǎn)

2、和焦點(diǎn)。本文采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，對(duì)GSH處理后的牛體外受精胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;獲得的lncRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示其在早期胚胎抗氧化方面的功能，尋找其中起關(guān)鍵作用的調(diào)控分子或序列。
　　試驗(yàn)一，通過(guò)體外受精方法制備牛胚胎，并培養(yǎng)于含有3 mM GSH的培養(yǎng)液中;分別收集處于8～16-細(xì)胞期和桑椹期的胚胎，以非添加組為對(duì)照。每個(gè)樣品收集20枚胚胎，并做兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)，獲得lncRNA序列，并對(duì)其

3、進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測(cè)序共得到4273個(gè)lncRNAs，其中62％來(lái)源基因間區(qū);且其在各個(gè)染色體的分布沒(méi)有明顯的偏好性，說(shuō)明lncRNAs的轉(zhuǎn)錄是全基因組范圍的。lncRNA的平均表達(dá)值、平均長(zhǎng)度和平均外顯子個(gè)數(shù)都與已知lncRNA一致，證明測(cè)序鑒定lncRNA的可靠性。進(jìn)一步篩選出23個(gè)在對(duì)照組上調(diào)而處理組下調(diào)的lncRNAs，36個(gè)在對(duì)照組下調(diào)而處理組上調(diào)的lncRNAs。
　　試驗(yàn)二，在對(duì)照組和處理組中，23個(gè)lncRNAs

4、分別與599個(gè)和2554個(gè)蛋白編碼基因共表達(dá)，這些基因分別涉及25個(gè)和71個(gè)功能分類(lèi)，且主要參與6條和8條信號(hào)通路。36個(gè)lncRNAs分別與對(duì)照組的483和處理組的609個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因共表達(dá)，分別涉及18個(gè)和33個(gè)功能分類(lèi)，主要參與5條和10條信號(hào)通路。另外，發(fā)現(xiàn)14個(gè)lncRNAs共表達(dá)的差異基因參與谷胱甘肽代謝通路。對(duì)23個(gè)lncRNAs的臨近基因（上下游300 kb）進(jìn)行GO注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)其參與35個(gè)功能分類(lèi);而36個(gè)lncRNA

5、s的臨近基因則參與43個(gè)功能分類(lèi)。選取8個(gè)lncRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Fold Change比較，結(jié)果其中4個(gè)在處理組下調(diào)，其余4個(gè)則上調(diào)，與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果的可靠性?？梢?jiàn)，在體外培養(yǎng)液中添加GSH，對(duì)牛早期胚胎的lncRNA表達(dá)譜有顯著影響，但其對(duì)胚胎發(fā)育的作用及其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
　　試驗(yàn)三，建立牛顆粒細(xì)胞細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)3 mM和5 mM GSH處理后，采用熒光定量PCR檢測(cè)4個(gè)lncRN

6、As及6個(gè)谷胱甘肽合成和代謝相關(guān)基因在其中的表達(dá)水平。結(jié)果不同濃度的外源GSH均導(dǎo)致CUFF.152963.1和CUFF.30537.1的表達(dá)量顯著下調(diào);5mM GSH則顯著提高顆粒細(xì)胞中CUFF.33095.2的表達(dá)水平，而對(duì)CUFF.42178.2的表達(dá)沒(méi)有影響;3 mM GSH卻對(duì)CUFF.33095.2和CUFF.42178.2均沒(méi)有顯著影響。同時(shí)，3mM和5 mM GSH的處理均顯著影響顆粒細(xì)胞中GCLC、GCLM、 GSTA