泥蚶(Tegillarca granosa)抗氧化酶基因的克隆與表達分析.pdf

1、泥蚶(Tegillarca granosa)是我國主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一，具有很高的經(jīng)濟價值。然而，隨著工業(yè)廢水排放量的迅速增加，泥蚶的養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化。再加上累代人工養(yǎng)殖后，造成了泥蚶種質(zhì)退化，抗逆能力下降，由外界病原或者各種壓力產(chǎn)生的疾病頻繁地發(fā)生在泥蚶的群體中，造成了經(jīng)濟損失、食品安全等方面的問題。因此，對泥蚶功能基因尤其是抗逆相關(guān)基因的作用機制進行深入研究，對泥蚶養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。
　　泥蚶在受到外界病原或

2、者各種壓力脅迫刺激時，會發(fā)生呼吸爆發(fā)的現(xiàn)象，產(chǎn)生大量的活性氧來消除外來的病原體?；钚匝蹩梢詺缤鈦淼牟≡?，也可以在生物體內(nèi)發(fā)揮積極的生物學作用。但是，過量的活性氧會對機體的核酸、蛋白、生物膜等產(chǎn)生傷害，致使細胞凋亡，因此及時地清除機體內(nèi)過量的活性氧可以提高機體對外界病原體的抵抗力和免疫力。
　　抗氧化酶可以清除活性氧，是維持機體內(nèi)氧環(huán)境平衡，抵抗外界環(huán)境影響的重要因子。本研究采用同源克隆和RACE技術(shù)克隆了泥蚶抗氧化酶中的谷胱甘肽

3、過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的cDNA全長，并對這三個基因的結(jié)構(gòu)進行生物信息學分析。
　　1、泥蚶GPx基因(TgGPx) cDNA全長為1195bp，包含45bp5'-UTR，639bp開放閱讀框(ORF)和511bp3'-UTR。ORF編碼212個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白分子量為24.3kDa，理論等電點為8.33，其中，第53個氨基酸U是由密碼子UGA編碼的硒代半胱氨酸(Se-Cys)。在

4、3'-UTR上存在一段序列，形成一種獨特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即SECIS元件。SECIS元件在密碼子UGA翻譯為Se-Cys的過程中起決定性作用。TgGPx基因序列中存在GPx家族簽名序列LGFPCNQF和活性位點序列WNFEKF和保守的活性氨基酸。通過序列比對與系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)TgGPx與紫貽貝和三角帆蚌的相似度最高，與其他物種也具有較高的相似度。還發(fā)現(xiàn)在軟體動物中也存在不同種類的GPx基因，TgGPx與GPx1和GPx2的親緣關(guān)系較近;<

5、br>　　2、泥蚶CAT基因(TgCAT) cDNA全長為2017bp，包含73bp5'-UTR，1521bp開放閱讀框(ORF)和423bp3'-UTR，編碼506個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為57.4kDa，理論等電點為8.62。在TgCAT基因的氨基酸序列中存在近端活性位點FnReripERvvHakGAG和近端血紅素配體簽名序列RLFSYpDTH、兩個糖基化位點NFSQ和NWSK以及與功能相關(guān)的保守氨基酸，通過序列比對與系統(tǒng)進化分析

6、，發(fā)現(xiàn)TgCAT基因與合浦珠母貝、近江牡蠣等軟體動物的同源性最高，與其他物種也有較高的同源性，從NJ進化樹可以看出CAT基因基本遵循物種的進化規(guī)律;
　　3、泥蚶SOD基因(TgSOD) cDNA全長為696bp，包含46bp5'-UTR，465bp開放閱讀框(ORF)和185bp3'-UTR。ORF編碼154個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白分子量為15.86 kDa，理論等電點為6.16。TgSOD氨基酸序列中存在銅鋅超氧化物歧化酶蛋白家

7、族簽名序列GFHIHEFGDNT和GHAGGRLACGVI和銅鋅結(jié)合位點（Cu分別與His47，His49，His64，His121配位，Zn則與His64，His72，His81，Asp84配位）。通過序列比對與系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)TgSOD基因氨基酸序列與智利貽貝、近江牡蠣等軟體動物的同源性最高，與其他物種序列也具有較高的相似性，從NJ進化樹可以看出Cu/Zn SOD基因并不嚴格遵循物種的進化規(guī)律。
　　4、利用實時定量PCR技

8、術(shù)對泥蚶谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶基因不同組織的表達情況以及在重金屬脅迫下的表達量變化情況進行分析，結(jié)果表明，TgGPx和TgCAT在泥蚶的5個組織中都有表達，但存在組織特異性。TgGPx基因在外套膜中的表達量最高，在血細胞中的表達量最低;TgCAT基因在鰓中表達量最高，在血細胞中表達量最低。用重金屬pb2+、Cu2+、Cd2+刺激后，TgGPx基因在pb2+處理組的表達量逐漸升高，在12h的表達量最高;在Cu2+處理組和Cd2+處

9、理組中TgGPx基因表達量的變化趨勢比較相似，為升高-降低-升高-降低，Cu2+處理組和Cd2+處理組的表達量均在24h達到最大值。TgCAT基因在經(jīng)過重金屬刺激后，在pb2+處理組和Cu2+處理組，表達量先降低然后升高。TgCAT在pb2+處理組的表達量在24h達到最高，在Cu2+處理組的表達量在48h達到最高;在Cd2+處理組，TgCAT基因的表達量的變化趨勢為升高-降低-升高-降低，在24h表達量達到最大值?？傊?，TgGPx和Tg