重組腺相關病毒載體介導血管緊張素Ⅱ受體1反義基因預防高鹽飲食誘導的高血壓及防治并發(fā)癥作用的實驗研究.pdf

1、腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮系統(tǒng)(RAS)被公認為是機體內調節(jié)心血管和腎臟功能的最重要體系之一。血管緊張素Ⅱ與血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)結合后強烈收縮血管、促進醛固酮分泌導致鈉水潴留，促使血壓升高。高鹽作為高血壓的一個重要的獨立病因一直廣受關注和爭議。目前的研究表明高鹽可以激活RAS系統(tǒng)，同時還可誘導血管緊張素Ⅱ受體1(AT1)的表達增加，這些均是導致血壓升高的原因。因此在本研究中我們利用重組雙鏈腺相關病毒(rAAV)為載體，將大鼠血管

2、緊張素Ⅱ受體1反義基因(反義AT1)導入長期高鹽飲食的SD大鼠體內，利用反義基因的作用減少AT1的表達，以研究反義AT1對高鹽誘導的高血壓和心血管系統(tǒng)及腎臟功能的影響。 重組雙鏈腺相關病毒載體(doublestrandedadeno-associatedvirusrAAV)是一種近年來被廣泛研究的基因載體，轉染后可獲得穩(wěn)定、長期、高效的表達，能轉染分裂期和非分裂期細胞；無免疫原性，轉染效率較高，而且它有獨特的優(yōu)點——可以整合到生

3、物染色體的特定部位，解決了病毒載體安全性的問題；而且無需像傳統(tǒng)的單鏈系統(tǒng)那樣進入體內后還要再復制成雙鏈。新的雙鏈系統(tǒng)表達更快，效率更高。 為了實現(xiàn)目的基因在罹患高血壓動物的體內長期、穩(wěn)定、安全的表達，從而達到長期、穩(wěn)定降壓的目的，并觀察它對各種高血壓并發(fā)癥的預防作用，我們將大鼠反義AT1基因克隆入重組雙鏈腺相關病毒載體中，并包裝成病毒顆粒，經過肝素柱純化獲得高滴度的rAAV-D(+)-AT1-AS病毒。然后分別經尾靜脈分別注射r

4、AAV-D(+)-AT1--AS(實驗組)和rAAV-D(+)-GFP(對照組)這兩種病毒顆粒(2×1010p.f.u/大鼠，每組6只)。2周后，以高鹽(8％氯化鈉)飼料喂養(yǎng)，注射前及注射后每2周監(jiān)測動脈收縮壓，每2周收集24小時尿。同時觀察動物行為變化，實驗周期為12周。實驗結束前經右頸總動脈插管，用美國PowerLab公司的心功能測定儀測定大鼠心功能的各項指標。最后處死動物，并取心、主動脈、腎等組織提取總RNA。用RT-PCR檢測A

5、T1mRNA的表達情況；檢測尿中Na+，K+及微量白蛋白的含量；主要臟器稱重并固定切片作形態(tài)學分析以觀察腎臟損傷情況和心血管重構情況。采用放免法檢測血漿AngⅡ濃度。 結果：①高鹽飲食1周后，對照組大鼠血壓開始明顯升高，實驗結束時血壓達到(142.7±4.5mmHg)；實驗組大鼠在前3周血壓也出現(xiàn)了輕度升高，3周后血壓一直穩(wěn)定在正常范圍，實驗結束時血壓維持在(117±3.8mmHg)。②經右頸總動脈插管進行血液動力學測定顯示，基

6、因導入使心功能得到顯著改善，實驗組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓峰值(LVPSP)及左室最大上升和下降速率(±dp/dtmax)值均較對照組有顯著性的差異；心率也明顯低于對照組。③半定量RT-PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)實驗組心臟、腎臟、血管的AT1基因的mRNA表達較對照組有顯著下降。④實驗組尿微量白蛋白的含量和Na+/K+比值明顯低于對照組；腎臟天狼星紅染色結果顯示：對照組腎臟間質纖維化，腎小球細動脈管壁增厚，膠原沉積，呈現(xiàn)纖維化

7、表現(xiàn)；而實驗組較為正常，未見明顯膠原沉積。這表明反義AT1基因可預防或明顯改善高鹽引起的腎功能損害。⑤心臟天狼星紅染色結果顯示：對照組心肌細胞肥大，排列紊亂，間質增生而治療組結構正常，心肌組織大量膠原沉積；而治療組結構正常未見異常的膠原沉積；這說明反義AT1可以預防高血壓引起的心肌重構；兩組動物的心臟重量和體重比也從側面證實了這些結果。⑥AngⅡ放免法檢測結果顯示：實驗組和正常組血漿AngⅡ維持在正常水平，對照組血漿AngⅡ明顯降低，證

8、明反義AT1基因治療雖下調了AT1的表達，但并未增加血漿AngⅡ的含量。 結論：由我們的結果可以看出，重組雙鏈腺相關病毒載體介導的大鼠反義AT1基因可以在動物體內持續(xù)穩(wěn)定地表達，在抑制動物血壓升高的同時，還發(fā)揮了預防高血壓的各種并發(fā)癥(包括腎臟損害和心血管系統(tǒng)重構等)的作用。而且實驗過程中兩組動物并未出現(xiàn)因為病毒載體注入和表達所引起的嚴重毒副作用。所以我們認為，重組雙鏈腺相關病毒載體介導的反義AT1基因為治療高血壓病、預防心血管