燕麥麩蛋白及ACE抑制肽制備工藝與功能特性研究.pdf

1、燕麥是一種糧草兩用作物，在我國的種植面積大，產(chǎn)量豐富，以裸燕麥為主。但由于目前我國燕麥深加工業(yè)技術(shù)相對比較落后，97％的燕麥直接用于飼糧，造成了資源的巨大浪費，也成為制約燕麥產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的瓶頸。因此如何對燕麥進行深加工并實現(xiàn)其高效增值是當前急需解決的問題。燕麥麩是燕麥粗加工過程中的主要副產(chǎn)物，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，具有良好的開發(fā)利用前景。本論文以燕麥麩為原料，對燕麥麩蛋白的組成、制備工藝、結(jié)構(gòu)特征及功能性質(zhì)等進行了系統(tǒng)的研究，在此基

2、礎(chǔ)上利用燕麥麩分離蛋白(OBPI)酶法生產(chǎn)了ACE抑制肽，旨在為燕麥的合理利用和高效增值提供指導意義和理論依據(jù)。 論文首先分析了燕麥麩蛋白的組成特點，結(jié)果表明球蛋白含量最高(40.18％)，其次是谷蛋白(33.64％)，醇溶蛋白和清蛋白含量較低，分別為9.15％和7.45％。根據(jù)這種分布特點，確定采用堿溶酸沉工藝制備OBPI并優(yōu)化了工藝條件，在優(yōu)化的工藝條件下(pH9.6，溫度50℃，料水比1:18，浸提時間30min)，蛋白提

3、取率為46.7％，產(chǎn)品得率為7.9％，蛋白質(zhì)含量為74.4％。針對傳統(tǒng)工藝在提取過程中出現(xiàn)的液料比要求高，蛋白提取率偏低等問題改進了工藝，在蛋白提取前增加了復合多糖酶Viscozyme L預處理過程，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶預處理工藝參數(shù)。改進后的工藝能將蛋白提取率提高到56.2％，產(chǎn)品得率為9.1％，蛋白質(zhì)含量達81.7％。 采用Sepharose CL-6B凝膠層析和SDS-PAGE方法對OBPI進行分析，結(jié)果表明：OBPI中

4、主要的蛋白組分為球蛋白，其分子內(nèi)包括酸性肽鏈(31～38kDa)和堿性肽鏈(20～22kDa)，它們通過二硫鍵相連接，相對分子質(zhì)量約60k，其他蛋白組分對OBPI的交叉污染很少；氨基酸分析結(jié)果顯示OBPI的氨基酸組成比較平衡，其中Glu、Arg、Leu和Asp等四種氨基酸在OBPI中的含量最豐富，而Cys和Met的含量較低，Lys、Met和Thr為其限制性氨基酸；DSC分析表明OBPI的熱變性峰值溫度為115.4℃；圓二色性分析結(jié)果顯示

5、OBPI中主要含β-折疊結(jié)構(gòu)(44.3％)，其次是無規(guī)卷曲(27.8％)和α-螺旋(21.9％)，β-轉(zhuǎn)角含量最少，不足10％。 在中性或弱酸性條件下(一般食品體系的pH環(huán)境)，OBPI的溶解性、乳化活性和起泡性均較差，不利于在食品工業(yè)中的應(yīng)用；采用兩種商業(yè)化蛋白酶一堿性蛋白酶(Alcalase 3.0T)和胰蛋白酶(Trypsin PTN6.0S)分別對OBPI進行了改性，均取得良好的效果。SDS-PAGE和HPLC分析結(jié)果顯

6、示酶解能導致蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，酶解部位主要集中在蛋白的酸性肽鏈，而堿性肽鏈相對保持完整，同時由于兩種蛋白酶特異性的不同，所得到的酶解產(chǎn)物在組成和功能性質(zhì)上存在著差異；在所考察的水解度范圍內(nèi)，Alcalase水解物的溶解性隨DH的升高而增加，持水性、乳化活性和起泡性先增加后降低，而持油性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性均有不同程度的降低；Trypsin水解物的溶解性、持水性、乳化活性和起泡性均隨DH的增加而不斷增加，但持油性、乳化穩(wěn)定性和

7、泡沫穩(wěn)定性有所降低。 探討了酶法水解OBPI制備高ACE抑制活性肽的可能性。通過比較不同的蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性，結(jié)果顯示Alcalase和Trypsin是生產(chǎn)燕麥麩蛋白ACE抑制肽的合適用酶；考察了兩種蛋白酶水解蛋白產(chǎn)物的DH與ACE抑制活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)未水解的燕麥麩蛋白無ACE抑制活性，酶解后活性顯著增強，但達到最大活性存在一個最佳的水解度，Alcalase為DH11.0％，Trypsin為DH12.2％，對應(yīng)的

8、IC<,50>值分別為0.291 mg/mL和0.398 mg/mL；兩種酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量都比較低，主要的氨基酸為Glu、Leu、Pro和Phe等，而Trp、Met、Cys和His的含量較低；通過體外模擬消化道環(huán)境試驗研究了胃腸道消化酶對兩種酶解物的ACE抑制活性的影響，結(jié)果表明消化后的Alcalase水解物的ACE抑制活性有所降低，而Trypsin水解物活性升高；但它們的相對活性仍維持在一個較高的水平，說明兩種水解物中主要的活性

9、肽組分能一定程度上抵抗消化酶的水解作用。 采用離子交換法脫鹽和超濾處理精制了高ACE抑制活性的燕麥麩蛋白酶解物。離子交換法能有效脫除燕麥麩蛋白酶解液中的大部分鹽分，在合適的洗脫流速和溫度條件下能保證脫鹽率不低于81％，蛋白回收率在85％以上，同時脫鹽處理不會造成樣品ACE抑制活性的損失。超濾處理對富集酶解物中ACE抑制肽的作用明顯，采用截留相對分子質(zhì)量為10000的濾膜超濾處理后，Alcalase酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性提高了1

10、.4倍，蛋白回收率為68.3％；Trypsin酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性提高了1.5倍，蛋白回收率為52.6％。經(jīng)過精制的兩種酶解產(chǎn)物中灰分含量不超過2％，蛋白含量均在88％以上，且其中的小分子肽和疏水性氨基酸含量有所提高。 連續(xù)采用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換、Sephadex G-25凝膠過濾和RP-HPLC等分離手段從OBPI水解物中分離出五種活性較強的ACE抑制肽，并通過MALDITOF-TOF