H2S誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝物累積的激素生理機(jī)制的初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以白樺懸浮細(xì)胞為材料，將不同濃度硫化氫(H2S)供體硫氫化鈉(NaHS)添加到白樺懸浮培養(yǎng)體系中，篩選有利于白樺懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)、三萜、黃酮和多酚等次生代謝物積累的NaHS處理濃度和時(shí)間，并分析細(xì)胞內(nèi)吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和多胺(PAs)的含量及其合成關(guān)鍵酶的活性或基因表達(dá)量。同時(shí)分析不同濃度IAA、ABA、PAs與NaHS共處理對(duì)白樺懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝物積累的影響。通過上述研究初步明確內(nèi)源性激素和次

2、生代謝物對(duì)H2S的響應(yīng)，同時(shí)為明確白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝積累的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.H2S對(duì)白樺懸浮細(xì)胞防御生理的影響
　　將0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L和5mmol/L NaHS分別添加到培養(yǎng)8d的白樺懸浮培養(yǎng)體系中處理3～96h，研究發(fā)現(xiàn)0.1mmol/L NaHS處理提高了細(xì)胞活力同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)，而高于1mmol/L NaHS處理則降低細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。其中，0.

3、1mmol/L NaHS處理96h時(shí)細(xì)胞活力最高，比對(duì)照組提高了37.66％。而5mmol/LNaHS處理96h時(shí)細(xì)胞活力最低，降低至對(duì)照組的24.09％。
　　不同濃度NaHS處理對(duì)pH、電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響發(fā)現(xiàn)，0.1mmol/LNaHS對(duì)pH、電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響不顯著，與對(duì)照組相近。而高于1mmol/L NaHS處理則pH降低、電導(dǎo)率和丙二醛含量增加，其中5mmol/LNaHS處理96h時(shí)達(dá)到最大值，pH值下降0.

4、73，電導(dǎo)率提高了89.15％，丙二醛含量提高了44.62％。
　　不同濃度NaHS處理對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)防御酶的影響發(fā)現(xiàn)，除0.1mmol/L NaHS處理外，細(xì)胞內(nèi)防御酶活性均顯著提高。其中1mmol/L NaHS處理96h時(shí)SOD活性最高，比對(duì)照組提高了41.04％。1mmol/L NaHS處理24h時(shí)POD活性最高，比對(duì)照組提高了94.55％。1

5、mmol/L NaHS處理48h時(shí)CAT活性最高，比對(duì)照組提高了150％。0.5mmol/L NaHS處理24h時(shí)PAL活性最高，比對(duì)照組提高了71.43％。
　　2.H2S對(duì)白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝物積累的影響
　　利用不同濃度NaHS處理白樺懸浮細(xì)胞。除5mmol/L NaHS外，NaHS處理提高了白樺懸浮細(xì)胞中次生代謝物含量。其中1mmol/L NaHS處理24h時(shí)次生代謝產(chǎn)物含量最高，三萜、黃酮、多酚含量分別比對(duì)照組提

6、高了36.67％、28.57％、36.89％。
　　低濃度NaHS處理有利于白樺懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而較高濃度的NaHS處理有利于次生代謝物的累積，NaHS對(duì)次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物促進(jìn)作用多酚＞三萜＞黃銅。
　　3.H2S對(duì)白樺懸浮細(xì)胞中內(nèi)源性激素含量和合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響
　　利用不同濃度NaHS處理白樺懸浮細(xì)胞。NaHS處理降低了細(xì)胞內(nèi)IAA含量，而增加了ABA、JA和PAs含量。(1)0.5mmol/L以上NaHS處理組

7、IAA含量逐漸降低。其中在次生代謝產(chǎn)物積累最高的1mmol/L NaHS處理24h時(shí)IAA含量?jī)H占對(duì)照組的46.78％，此時(shí)GH3.5A、GH3.5B、GH3.9A三個(gè)基因表達(dá)量分別比對(duì)照組提高158.12％、307.47％、509.73％倍（TU內(nèi)參）;(2) NaHS處理后ABA含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中1mmol/L NaHS處理12h時(shí)ABA含量最高，比對(duì)照組提高了196.46％。而NCED4基因在1mmol/L NaHS

8、處理6h時(shí)表達(dá)量最高，比對(duì)照組提高了431.85％。(3) NaHS處理后總PAs含量提高。其中，1mmol/L NaHS處理12h時(shí)精胺酸脫羧酶活性最高比對(duì)照提高了15.91％，96h時(shí)總腐胺含量最高比對(duì)照組提高了20.34％。0.5mmol/L NaHS處理48h時(shí)S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶活性最高比對(duì)照提高了74.15％，總亞精胺含量最高比對(duì)照組提高8.41％(4) NaHS處理后JA含量呈先提高后降低趨勢(shì)。其中1mmol/L NaH

9、S處理12h時(shí)脂氧合酶活性最高，比對(duì)照組提高了22.39％，24h時(shí)JA含量最高，比對(duì)照組提高了67.17％。
　　NaHS處理后激素調(diào)控相關(guān)基因與激素合成酶活性改變誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)源性激素含量的變化。下面繼續(xù)探究激素含量與次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系。
　　4.H2S與激素共處理對(duì)白樺懸浮細(xì)胞次生代謝積累的影響
　　將不同濃度的IAA、ABA、Put、Spd、Spm分別添加到8天的白樺懸浮細(xì)胞中，使培養(yǎng)基中不同激素終濃度為0.

10、1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L和5mmol/L。同時(shí)分別將上述不同激素的濃度處理與1mmol/L的硫氫化鈉共處理白樺懸浮細(xì)胞處理24h。研究發(fā)現(xiàn)IAA處理降低了次生代謝產(chǎn)物積累，而ABA和PAs處理促進(jìn)了次生代謝產(chǎn)物的積累。(1)5mmol/L IAA處理次生代謝產(chǎn)物含量最低，多酚、黃酮和三萜含量分別為對(duì)照組的88.28％、86.44％和78.91％。5mmol/L IAA和1mmol/L硫氫化鈉共處理次生代謝產(chǎn)物含

11、量比IAA處理組提高，多酚、黃酮和三萜含量分別為對(duì)照組的111.16％、107.39％和93.82％。(2)1mmol/L ABA處理次生代謝產(chǎn)物含量最高，多酚、黃酮和三萜含量分別比對(duì)照組提高17.85％、23.48％和16.73％。1mmol/L ABA和1mmol/L硫氫化鈉共處理次生代謝產(chǎn)物含量提高，多酚、黃酮和三萜含量分別比對(duì)照組提高58.19％、46.02％和57.30％。(3)5mmol/L腐胺處理組中三萜含量最高比對(duì)照組提

12、高了22.91％，與硫氫化鈉共處理時(shí)三萜含量比對(duì)照提高了68.00％。1mmol/L精胺處理組中黃酮含量最高比對(duì)照提高了31.09％，與硫氫化鈉共處理時(shí)黃酮含量比對(duì)照組提高了48.62％。0.5mmol/L亞精胺處理組中多酚含量最高比對(duì)照組提高了37.17％，與硫氫化鈉共處理時(shí)多酚含量比對(duì)照提高了75.91％。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IAA和Put與次生代謝產(chǎn)物積累顯著相關(guān)，低于1mmol/L的ABA、Spd和SPM促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物積累。