耦合Ri質粒介導發(fā)根技術的喜樹次生代謝物研究.pdf

1、喜樹為中國特有樹種，喜樹堿系列衍生物抗癌藥物是附加值極高的產品。Ri質粒誘導的發(fā)根具有生長迅速、激素自養(yǎng)、生長條件簡單、次生代謝產物含量穩(wěn)定、分化程度高、不易變異等特點，而且可把代謝物分泌至培養(yǎng)基中。本研究用植物轉基因工具發(fā)根農桿菌，對喜樹進行基因干預，實現(xiàn)喜樹藥用價值次生代謝物的合成;用大孔吸附樹脂完成離線分離富集工作，用化學計算指導分子印跡化合物的設計和合成，探討喜樹發(fā)根培養(yǎng)次生代謝物的原位捕抓和專一吸附;用細胞模型（黑色素瘤細胞）

2、評價了喜樹次生代謝物的藥理活性，探討了次生代謝物的抗氧化能力，進一步闡明了相關物質的抗癌藥用機理和抗氧化能力。本研究的具體工作總結如下:
　　 1.建立了Ri質粒介導的喜樹發(fā)根的培養(yǎng)體系:選擇發(fā)根農桿菌種ATCC15834作為介導菌株;證實用無菌苗子葉進行發(fā)根培養(yǎng)，發(fā)根率最高，發(fā)根農桿菌經(jīng)液體培養(yǎng)至0D600為近0.8，稀釋5倍用于接種感染喜樹外植體;用250mg/L羧芐青霉素+250mg/L替漫汀抗菌;發(fā)根在含蔗糖30g/L的

3、HRIM培養(yǎng)基中生長較迅速，液體培養(yǎng)介質有利于喜樹發(fā)根生長，選8小時光照條件，發(fā)根的PH范圍以5.5-6.0為優(yōu)。
　　 2.確定了喜樹堿及羥基喜樹堿的定量測定方法;毛狀根的喜樹堿含量0.022mg.g-1(D.W)與正常根含量0.027mg.g-1(D.W)接近;30天培養(yǎng)基中喜樹堿含量達根含量的近30％。
　　 3.用大孔吸附樹脂離線分離富集培養(yǎng)基中次生代謝物，證實HPD722樹脂對喜樹堿效果最好;動態(tài)參數(shù)是:氯仿/

4、乙醇(1:1)作解吸液，解吸液PH值為3，上柱流速1.0ml/min，從培養(yǎng)基中提取了β-谷甾醇、喜樹堿、羥基喜樹堿;確定了金絲桃苷的存在。
　　 4.以與喜樹堿含有相似官能團的茶堿為模板分子，制備了對茶堿有良好吸附能力的單分散或窄分散分子印跡聚合物微球，為喜樹堿分子印跡微球的制備篩選了系列參數(shù):GMA和DVB用量配比為4∶6得到單分散的聚合物微球，微球的平均粒徑為2.65μm;分子印跡聚合物微球的接枝量可以通過控制PGMA-D

5、VB微球表面環(huán)氧基含量進行調整;當分子印跡聚合物的接枝量增大到12％時，其吸附量達到14μg/g。
　　 5.運用Gaussian03程序包，采用密度泛函理論(DFT，DensityFunctionalTheory)方法，對喜樹堿分子和功能單體分子丙烯酰胺以及二者所形成的復合物的構象進行幾何優(yōu)化，在此基礎上結合自然鍵軌道(NBO)進行計算并分析喜樹堿E環(huán)C-O鍵的成鍵性質，解釋其易分解的原因。對化合物數(shù)據(jù)庫進行搜索，尋找與喜樹堿

6、結構近似的分子:H
　　 (8-ethyl-8-hydroxybenzo[6,7]indolizino[2,3-b]quinoline-9,12(6H,8H)-dione)
　　 6.證實喜樹堿、羥基喜樹堿、β-谷甾醇對人A375細胞及鼠B16-F10細胞生長有顯著抑制作用，不同濃度處理后與對照組比較差別有顯著性(P＜0.05)，呈濃度時間依賴性;而金絲桃苷、白樺酯酸對人A375細胞及鼠B16-F10細胞生長沒有顯著抑制

7、作用;喜樹堿的抑制濃度(IC50)測得是35μmol/L，羥基喜樹堿的抑制濃度(IC50)測得是32μmol/L，β-谷甾醇的抑制濃度(IC50)測得是0.75mmol/L;喜樹堿對B16-F10細胞周期的影響是:改變細胞的周期分布，使細胞周期出現(xiàn)S期延長，G0-G1期縮短。
　　 7.通過鄰苯三酚自氧化法、清除DPPH自由基法和清除ABTS自由基三種方法得到金絲桃苷的抗氧化能力接近VC，β-谷甾醇的抗氧化能力與BTH接近的結果