不同異養(yǎng)細(xì)菌中H2S代謝及功能研究.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，存在于多種生產(chǎn)過(guò)程以及自然界中。H2S可以通過(guò)抑制呼吸鏈而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)的活動(dòng)，是工業(yè)生產(chǎn)中僅次于CO的第二大殺手。20世紀(jì)90年代，研究者發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以內(nèi)源產(chǎn)生H2S，提示H2S可能具有一定的生理作用。隨著近年來(lái)相關(guān)研究的逐漸深入，H2S已被認(rèn)為是繼CO和NO之后的第三類(lèi)氣體信號(hào)分子。
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，H2S主要來(lái)源于含硫氨基酸，包括半胱氨酸、甲硫氨酸及胱氨

2、酸，H2S產(chǎn)生過(guò)程涉及的酶主要有三個(gè):胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚β-合成酶(CBS)與3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中H2S的過(guò)度產(chǎn)生與積累可能會(huì)抑制呼吸，產(chǎn)生毒性作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞為了避免體內(nèi)積累過(guò)多的H2S，通常會(huì)通過(guò)酶促氧化將內(nèi)源產(chǎn)生的過(guò)量H2S重新氧化為硫代硫酸鹽。H2S的氧化過(guò)程主要涉及三個(gè)酶:硫醌氧化還原酶(SQR)、硫轉(zhuǎn)移酶(RHOD)和過(guò)硫化物雙加氧酶(PDO)。
　　自養(yǎng)細(xì)菌中H2S的

3、氧化途徑及其在能量代謝中的作用已經(jīng)得到了較為深入的研究。已報(bào)道的SQR主要分布于化能自養(yǎng)菌及光合硫氧化細(xì)菌中，可以分為六類(lèi)。在革蘭氏陰性自養(yǎng)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了兩種類(lèi)型的PDO，能夠催化相同的底物，序列相似性較高，在革蘭氏陽(yáng)性自養(yǎng)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)另外一類(lèi)PDO，與革蘭氏陰性自養(yǎng)細(xì)菌中兩類(lèi)PDO的序列相似性較低，且作用底物不同。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，異養(yǎng)細(xì)菌中同樣含有SQR、PDO及RHOD的編碼基因，而且上述蛋白同樣在硫化物的氧化代謝中發(fā)揮作用。例如

4、實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)在異養(yǎng)細(xì)菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中，SQR首先氧化硫化物生成多硫化物，多硫化物與GSH發(fā)生自發(fā)反應(yīng)生成GSSH，然后PDO氧化GSSH生成亞硫酸鹽，生成的亞硫酸鹽會(huì)與多硫化物發(fā)生自發(fā)反應(yīng)生成硫代硫酸鹽，RHOD能夠加速多硫化物與GSH的反應(yīng)。
　　基于上述研究，推測(cè)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)類(lèi)似,H2S的產(chǎn)生與代謝可能廣泛存在于細(xì)菌中且具有一定的生理作用。本文首先通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)

5、已全基因組測(cè)序的細(xì)菌及古菌中的SQR及PDO進(jìn)行分析，確定SQR及PDO編碼基因廣泛存在于不同的細(xì)菌與古菌中，也有部分細(xì)菌與古菌中不含SQR及PDO編碼基因?？紤]到自養(yǎng)細(xì)菌中H2S的代謝已經(jīng)研究的較為深入，本文針對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌中H2S的產(chǎn)生及代謝開(kāi)展了后續(xù)研究。具體研究對(duì)象為C.pinatubonensis JMP134、Pseudomonas aeruginosa PAO1與Escherichia coli BL21(DE3)，其中E.c

6、oli BL21(DE3)基因組中不含SQR及PDO編碼基因;C.pinatubonensis JMP134基因組中含SQR及PDO編碼基因，且SQR及PDO編碼基因位于同一個(gè)操縱子上;P.aeruginosa PAO1基因組中含SQR及PDO編碼基因，但SQR及PDO編碼基因在基因組上相距較遠(yuǎn)。通過(guò)對(duì)上述菌株中SQR及PDO編碼基因進(jìn)行敲除、回補(bǔ)、過(guò)表達(dá)及H2S氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)細(xì)菌中SQR及PDO能夠代謝自身產(chǎn)生的H2S，因而含

7、有SQR及PDO的菌株在培養(yǎng)過(guò)程中并不積累和釋放H2S;在混合培養(yǎng)過(guò)程中，含有SQR及PDO的菌株能夠代謝其他菌株釋放的H2S。同時(shí)以P.aeruginosa PAO1為代表性菌株，對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌中H2S產(chǎn)生途徑進(jìn)行了研究，確認(rèn)P.aeruginosa PAO1中既含有催化有機(jī)硫化物生成H2S的三個(gè)酶CBS、CSE及3-MST，也含有催化無(wú)機(jī)硫化物生成H2S的業(yè)硫酸鹽還原酶。經(jīng)過(guò)對(duì)P.aeruginosa PAO1中已知的H2S合成與代謝相

8、關(guān)基因的順序敲除，得到如下菌株:H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a3K（Pa△sqr1△sqr2△pdo）、H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）、H2S合成與代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr2△pdo)。Pa7K既不含有H2S生成基因也不含有H2S代謝基因，在豐富培養(yǎng)基LB中的生長(zhǎng)并未受到影響，也不向外釋放H2S。如果向LB培養(yǎng)基中添加過(guò)量的半胱氨

9、酸，Pa7K仍然會(huì)產(chǎn)生大量H2S，說(shuō)明P.aeruginosa PAO1通過(guò)有機(jī)途徑產(chǎn)生H2S的過(guò)程比較復(fù)雜，除了已報(bào)道的合成相關(guān)蛋白外，還存在其他未知的可催化H2S產(chǎn)生的酶;在添加過(guò)量無(wú)機(jī)硫源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，Pa7K不再產(chǎn)生并積累H2S，說(shuō)明P.aeruginosa PAO1通過(guò)無(wú)機(jī)硫源產(chǎn)生H2S的途徑較為單一，其中關(guān)鍵酶為亞硫酸鹽還原酶。
　　通過(guò)對(duì)不同異養(yǎng)細(xì)菌中H2S代謝相關(guān)基因的比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Cupriavidu

10、s necator H16基因組中不含有SQR編碼基因sqr，但其在培養(yǎng)過(guò)程并不釋放H2S。對(duì)C.necator H16基因組的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌株含有編碼黃素細(xì)胞色素硫脫氫酶(FCSD)的fccAB基因。FCSD在光合細(xì)菌中有報(bào)道，包含一個(gè)大的能夠結(jié)合硫的黃素蛋白亞基(FccB)和一個(gè)小的cytochrome c亞基(FccA)，其體外功能與SQR類(lèi)似，能夠氧化硫化物生成零價(jià)硫，與SQR不同之處在于，F(xiàn)CSD氧化硫化物過(guò)程中生成的電

11、子會(huì)傳遞給cytochrome c。目前關(guān)于FCSD是否在體內(nèi)可以行使與SQR類(lèi)似的催化硫化物氧化的功能并未確定。本文對(duì)C.necator H16中FCSD編碼基因進(jìn)行了敲除、回補(bǔ)、過(guò)表達(dá)及H2S氧化能力分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)CSD能夠代謝C.necator H16內(nèi)源產(chǎn)生的H2S，突變菌株Cn△fccAB喪失了H2S代謝能力并向外釋放H2S。在P.aeruginosa PAO1的H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a3K(Pa△sqr1△sq

12、r2△pdo)中對(duì)fccAB過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FCSD在Pa3K中也具有氧化硫化物的活性，而且與SQR類(lèi)似，F(xiàn)CSD氧化H2S產(chǎn)生的多硫化物也包含二硫化物和三硫化物。進(jìn)一步在Pa3K中對(duì)fccAB與pdo進(jìn)行共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FCSD與PDO能夠協(xié)同代謝H2S。具體過(guò)程為:FCSD氧化H2S生成多硫化物，多硫化物與GSH自發(fā)反應(yīng)生成GSSH，接下來(lái)GSSH在PDO的作用下氧化生成亞硫酸鹽，生成的亞硫酸鹽能夠與多硫化物發(fā)生反應(yīng)生成硫代硫酸鹽，該途徑與

13、C.pinatubonensis JMP134中SQR/PDO氧化硫化物的途徑類(lèi)似，區(qū)別在于C.necator H16并不含有加速多硫化物與GSH反應(yīng)的RHOD。生物信息學(xué)分析顯示，在已全基因組測(cè)序的4929株細(xì)菌中，有190個(gè)菌株含有FccB，且大部分fccB與fccA在基因組上相鄰排列。FccBs可以分為三類(lèi)，每一類(lèi)在進(jìn)化上都是相對(duì)保守的。
　　P.aeruginosa是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛分布于不同生境之中。P.a

14、eruginosa PAO1基因組中含有cbs、cse、mst、cysI等H2S合成相關(guān)基因，以及sqr與pdo等H2S代謝相關(guān)基因。為了進(jìn)一步了解H2S產(chǎn)生與代謝在異養(yǎng)細(xì)菌中的生理功能，接下來(lái)對(duì)P.aeruginosa PAO1及其各突變菌株的幾個(gè)代表性表型:綠膿菌素的產(chǎn)生、生物膜的形成、運(yùn)動(dòng)性、血平板上的菌落形態(tài)、鼠李糖脂的產(chǎn)生及致病能力等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P.aeruginosa PAO1和H2S代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)

15、a3K(Pa△sqr1△sqr2△pdo)表型基本相同，而H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S(Pa△cbs△cse△mst△cysI)和H2S合成與代謝相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a7K(△cbs△cse△mst△cysI△sqr1△sqr△pdo)表型基本相同，說(shuō)明H2S合成而非H2S的代謝對(duì)P.aeruginosa PAO1的各類(lèi)表型會(huì)產(chǎn)生影響。具體而言，P.aeruginosa PAO1內(nèi)H2S合成相關(guān)基因的缺失，嚴(yán)重影響了該菌株綠膿菌

16、素的產(chǎn)生、運(yùn)動(dòng)能力、鼠李糖脂的產(chǎn)生等表型，且H2S合成相關(guān)基因突變菌株對(duì)萵苣葉柄的感染能力顯著下降。對(duì)P.aeruginosa PAO1及H2S合成相關(guān)基因敲除菌株P(guān)a△H2S（Pa△cbs△cse△mst△cysI）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果顯示H2S合成相關(guān)基因的缺失影響了P.aeruginosa PAO1的群體感應(yīng)系統(tǒng)，考慮到前述表型多受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，推測(cè)H2S合成基因的缺失首先導(dǎo)致P.aeruginosa PAO1喪失H2S合