Pseudoalteromonas arctic GS230產(chǎn)低溫α-淀粉酶的研究.pdf

1、α-淀粉酶(α-amylase)為α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrolaseEC.3.2.1.1)，能水解淀粉分子內(nèi)部α-1，4-葡萄糖苷鍵，水解產(chǎn)物有糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖，是最重要的工業(yè)酶制劑之一，已廣泛應(yīng)用在食品、發(fā)酵、紡織、造紙和制藥等諸多行業(yè)。本文主要對一株分離自連云港海域的低溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌株GS230的鑒定、產(chǎn)酶發(fā)酵條件、α-淀粉酶基因的克隆和在大腸桿菌中

2、的表達、重組酶的純化和酶學性質(zhì)等進行了較為系統(tǒng)的研究。 從連云港高公島海域篩選到一株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株GS230。該菌株為革蘭氏陰性桿菌、有莢膜、無芽孢，直徑為0.5-0.7μm×1.1-1.7μm，菌株生長溫度范圍4-35℃，最適生長溫度25℃；生長pH范圍為4-11，其最適生長pH為7.0；生長NaCl濃度范圍為0-10％，最適NaCl濃度為5％；根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性以及16SrRNA基因序列分析結(jié)果，鑒定菌株GS2

3、30為Pseudoalteromonasarctic。 P.arcticGS230菌株發(fā)酵24h后到達產(chǎn)α-淀粉酶高峰，產(chǎn)酶溫度范圍為4-35℃，最適產(chǎn)酶溫度為20℃；產(chǎn)酶pH范圍為4.0-10.0，最適產(chǎn)酶pH為8.0；裝液量在15-25％范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高。可溶性淀粉、糊精、馬鈴薯淀粉、牛肉膏和蛋白胨促進產(chǎn)酶；正交優(yōu)化實驗中在0.4％的可溶性淀粉、0.25％的牛肉膏、1.5％的蛋白胨以及2.5％的接種量下，發(fā)酵32h產(chǎn)酶量達到最

4、高。 根據(jù)NCBI中已報道的α-淀粉酶的基因序列設(shè)計簡并引物，通過PCR方法獲得了P.arcticGS230α-淀粉酶基因的保守序列，通過在基因的上下游保守區(qū)設(shè)計引物，擴增了α-淀粉酶基因兩端的序列。通過序列分析和拼接獲得了編碼P.arcticGS230α-淀粉酶基因，全長1431bp。經(jīng)生物信息學軟件分析該基因與P.haloplanktis的α-淀粉酶親緣關(guān)系最近，同源性達到98％。該α-淀粉酶基因含有與4個α-淀粉酶保守區(qū)域

5、。通過分析密碼子的使用情況得知，該α-淀粉酶存在著少數(shù)稀有密碼子。 研究了重組酶的純化和酶學性質(zhì)。經(jīng)過DEAE離子交換層析、Ni親和層析重組酶得到純化。對重組酶酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的分子量約為51.5KD與分析一致。重組α-淀粉酶的最適作用溫度30℃，在0℃和5℃分別有33％和50％的酶活力。Ca2+可以提高重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性，酶在20、30、40℃分別保溫2.5h后，其殘余酶活分別為74％、27％和2％。重組酶最適作用