哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞OGG1表達(dá)與DNA損傷氧化損傷.pdf

1、目的:氧化應(yīng)激指體內(nèi)氧化和抗氧化失衡引起的生理生化過(guò)程,近年來(lái)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展,是導(dǎo)致重癥哮喘發(fā)生的重要原因之一,能夠引起細(xì)胞DNA損傷。作為胞內(nèi)修復(fù)蛋白8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶,主要受氧化應(yīng)激調(diào)節(jié),其表達(dá)特異性,表達(dá)量的多少以及與氧化損傷的程度的關(guān)系尚有許多疑問(wèn)。本實(shí)驗(yàn)著重哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞,探討8-羥基鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶(簡(jiǎn)稱:OGG1)在哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)與氧化應(yīng)激相關(guān)性和DNA氧化損傷情

2、況。方法:收集2011.2-2011.12瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診的哮喘患者16例,按照GINA(全球哮喘防治創(chuàng)議)標(biāo)準(zhǔn)診斷程序明確支氣管哮喘診斷,按照 GINA指南急性發(fā)作期嚴(yán)重程度分級(jí)分為輕中度哮喘組,重癥哮喘組,正常人作為對(duì)照。所有研究患者均處于急性發(fā)作期,對(duì)照組為健康體檢者。分別抽取外周靜脈血,分離血清備用;淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)備用。分別用熒光探針DCF-DA和DHE標(biāo)記測(cè)量各組中胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度,并用

3、WST法測(cè)量外周血血清中SOD表達(dá),檢測(cè)體內(nèi)氧化應(yīng)激情況;同時(shí)取外周血單個(gè)核細(xì)胞做單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其外周血單個(gè)核細(xì)胞中DNA損傷情況;為測(cè)量外周血單個(gè)核細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 OGG1表達(dá)使用間接熒光免疫方法流式細(xì)胞儀測(cè)量,并在激光共聚焦觀察細(xì)胞形態(tài)。同理,運(yùn)用間接熒光免疫檢測(cè)外周血中單個(gè)核細(xì)胞胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活化因子NF-κB表達(dá)。結(jié)果均使用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)軟件,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( sx±)表示。組間比較采用q檢驗(yàn),相關(guān)分析采用直線

4、相關(guān)分析;以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.研究對(duì)象一般情況觀察:用藥前,輕中患者組均能聞及哮鳴音,3例可聞及少許濕羅音,3例出現(xiàn)口唇發(fā)紺,吸氧前SpO2為54-95％,吸氧后血?dú)馓崾揪鶡o(wú)呼吸衰竭。而重癥組呼吸困難均明顯,口唇發(fā)紺,端坐呼吸。5例患者煩躁不安,3例出現(xiàn)呼吸極度困難,雙肺大量哮鳴音和較多濕羅音。吸氧前SpO2均小于89％。SPO2為43-84％,吸氧后血?dú)馓崾居孝蛐秃粑ソ?。所有患者體溫均正常。2.熒光探針DC

5、FH-DA標(biāo)記外周單個(gè)核細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,輕中度和重癥組平均熒光強(qiáng)度分別為(37.81±11.67,65.8±19.27),與正常對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度相比(10.90±3.01)明顯增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在重癥哮喘患者平均熒光強(qiáng)度明顯高于正常組 P=0.002,與輕中度哮喘相比熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)P=0.046;酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果顯示:OD值在輕中組和重癥組與對(duì)照組相比,增高倍數(shù)為(1.29±0.38,2.67±1.13

6、);重癥組與輕中度組相比亦明顯增高,P=0.00139,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輕中度組較正常組明顯增強(qiáng) P=0.011,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞離心后,激光共聚焦下觀察,輕中組和重癥組平均熒光強(qiáng)度分別為(15.63±5.82,35.56±16.15),與正常對(duì)照組(6.08±6.11)熒光強(qiáng)度明顯增高。P值分別為0.019,0.003。重癥組與輕中度相比,P=0.029,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同理用DHE探針標(biāo)記測(cè)量胞內(nèi)ROS激光共聚焦下觀察

7、,輕中組和重癥組平均熒光強(qiáng)度分別為(16.70±14.95,33.52±15.58),與對(duì)照組熒光強(qiáng)度(2.20±1.47)相比明顯增強(qiáng)。重癥組與輕中組比較,P=0.002,輕中度與正常組相比,P=0.00036。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。3.DNA損傷情況(單細(xì)胞凝膠電泳激光共聚焦下測(cè)定DNA拖尾長(zhǎng)度):用單細(xì)胞凝膠電泳的方法檢測(cè)外周單個(gè)核細(xì)胞 DNA損傷情況,圖像用cometscore軟件分析尾長(zhǎng),輕中組,重癥組尾長(zhǎng)分別為

8、(22.27±22.26,99.12±90.97,),明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(0.70±0.62),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。重癥哮喘組彗星實(shí)驗(yàn)拖尾最長(zhǎng),輕中組長(zhǎng)于正常組。重癥哮喘與正常組和輕中組相比,尾長(zhǎng)更長(zhǎng) p<0.05,輕中度組尾長(zhǎng)長(zhǎng)于正常組p<0.05。4.外周單個(gè)核細(xì)胞OGG1表達(dá)水平:采用間接熒光免疫流式細(xì)胞儀檢測(cè),OGG1陽(yáng)性表達(dá)流式結(jié)果顯示輕中度,重癥哮喘組陽(yáng)性表達(dá)率分別為(26.29±16.17,51.95±19.1

9、0),與對(duì)照組(10.17±9.05)相比較表達(dá)率明顯增高,p<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重癥哮喘組與輕中度哮喘組相比表達(dá)明顯增加 p=0.003,輕中度與正常組比較P=0.048。激光共聚焦下觀察細(xì)胞內(nèi)OGG1表達(dá)在輕中度哮喘組,重癥哮喘平均熒光輕度分別為(12.15±2.67,24.23±10.25),與正常對(duì)照組(3.52±3.76)相比明顯增高。重癥哮喘組與輕中度組合正常人相比,P值分別為0.036,0.0014。5.酶標(biāo)儀

10、測(cè)量血清中SOD水平顯示:采用了目前測(cè)定SOD方法中WST-1法檢測(cè)血清中SOD水平,發(fā)現(xiàn)在SOD在正常組,輕中組,重癥組分別為(0.39±0.1,0.22±0.03,0.15±0.03),正常組比輕中組高,P,=0.004,與重癥組相比,P=0.00038,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在重癥組中SOD比輕中度數(shù)值低,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.外周血單個(gè)核細(xì)胞 NF-κB:間接熒光免疫方法,激光共聚焦下觀察外周血單個(gè)核細(xì)胞 NF-κB表達(dá),在正常

11、組,輕中組和重癥組平均熒光強(qiáng)度分別為(重癥組中平均熒光強(qiáng)度分別為(4.49±2.47,14.09±6.07,24.9±8.82),哮喘組較對(duì)照組明顯增高。P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1、哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高,血清中SOD水平明顯下降。表明:①氧化應(yīng)激參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展,在哮喘疾病發(fā)病機(jī)理中占有重要的作用。②哮喘疾病嚴(yán)重度與氧化應(yīng)激相關(guān)。2、哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞存在有DNA損傷。特別是重癥哮喘。疾病嚴(yán)重