白菜雄性不育相關(guān)基因BcMF15及其啟動(dòng)子的分離和功能驗(yàn)證.pdf

1、十字花科作物是我國(guó)栽培面積最大，總產(chǎn)量最高的一類蔬菜作物。同時(shí)它也是雜種優(yōu)勢(shì)利用最為廣泛的一類作物，其雄性不育的選育及其應(yīng)用基礎(chǔ)的研究深受人們重視。對(duì)雄性不育機(jī)理的研究可以了解小孢子的發(fā)育機(jī)制，還可以為人工創(chuàng)造雄性不育系提供理論依據(jù)，在生產(chǎn)實(shí)踐和理論上都具有十分重要的意義。本研究以白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino)減數(shù)分裂胞質(zhì)分裂突變體mmc(male meiotic cyto

2、kinesis)的野生型(可育株)花粉轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的基因BcMF15(Brassica campestris Male Fertility 15)為研究對(duì)象，采用RACE技術(shù)擴(kuò)增分離花粉發(fā)育相關(guān)的LTP基因BcMF15的eDNA和DNA序列全長(zhǎng)，分析其序列特征并預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。采用RT-PCR分析BcMF15在白菜不同發(fā)育階段生殖器官和營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)狀況．在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了由組成型啟動(dòng)子CaMV35S (Cauliflowe

3、r mosaic virus 35S)驅(qū)動(dòng)的BcMF15干涉基因表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)菜心[B.eampestris L. ssp.chinensis Markino var.parachinensis(Bailey)Tsen et Lee]進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以獲得該基因功能缺失突變體，從而分析其在花粉發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能。獲得的主要研究結(jié)果如下： (1)采用RACE技術(shù)從白菜可育株中成功克隆到花粉發(fā)育相關(guān)的BcMF15(Genbank

4、登錄號(hào)：EF600901)。序列分析表明該基因cDNA序列全長(zhǎng)768 bp，最大開(kāi)放閱讀框312 bp，編碼了103個(gè)氨基酸，該蛋白分子重量約11.36 kDa，屬于一個(gè)跨膜蛋白，具有顯著的疏水區(qū)．蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明：該氨基酸序列存在6個(gè)推定的結(jié)構(gòu)域：包括信號(hào)肽，跨膜域，vWF結(jié)構(gòu)域，C4-鋅指結(jié)構(gòu)域，Tryp_alpha__amyl結(jié)構(gòu)域，AAI結(jié)構(gòu)域。感興趣的是AAI結(jié)構(gòu)域包含在許多花粉發(fā)育關(guān)鍵的蛋白中。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)

5、庫(kù)BLAST同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)BcMF15序列與擬南芥((Columbia)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移相似蛋白(lipid transfer protein,LTP)有88％的相似性，且具有LTP的典型結(jié)構(gòu)特征。RT-PCR對(duì)其時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因在可育系的1～5級(jí)花蕾中表達(dá)，并持續(xù)表達(dá)直到嫩角果的形成，在花莖和花莖葉等孢子體組織中未檢測(cè)到BcMF15的表達(dá)，而在不育系的對(duì)應(yīng)組織均沒(méi)有表達(dá)，因此，推測(cè)其與花粉發(fā)育密切相關(guān)． (2)根據(jù)Bc

6、MF15 DNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到十字花科6屬10個(gè)物種的LTP同源序列，序列特征分析表明：不同植物物種LTP同源氨基酸序列在N端有長(zhǎng)度為26個(gè)氨基酸殘基的保守區(qū)域，而在C端則存在一定程度的變異。對(duì)LTP基因同源序列比對(duì)分析的結(jié)果表明：在核苷酸水平上的序列相似性在80％以上，氨基酸序列相似性大于53％．說(shuō)明了LTPs在十字花科中相對(duì)保守。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建其MP(The maximum parsimony)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，

7、結(jié)果表明：蕓薹屬與蘿卜屬關(guān)系較近，其次為薺菜屬、擬南芥屬和山芥屬，與諸葛菜屬關(guān)系最遠(yuǎn)。 (3)構(gòu)建了BcMF15基因含有組成型啟動(dòng)子CaMV35S的RNA干涉載體pm35S-RMF15，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的BcMF15基因RNA干涉植物表達(dá)載體導(dǎo)入菜心中，獲得了菜心轉(zhuǎn)BcMF15干涉基因植株。 (4)對(duì)BcMF15干涉載體轉(zhuǎn)化獲得的KanR菜心植株進(jìn)行了分子、形態(tài)和細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)前

8、期經(jīng)PCR和Southern印跡雜交檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBI35S-RMF15株系，以花蕾包括小蕾，中蕾，大蕾、開(kāi)放的花、嫩角果的cDNA為模板，對(duì)pBI35S-RMF15菜心轉(zhuǎn)基因植株和正常植株在花粉發(fā)育的不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：pBI35S-RMF15在各級(jí)花蕾和開(kāi)放花中的表達(dá)都明顯低于對(duì)照，且在中、大蕾時(shí)期降低更為顯著。這說(shuō)明pBI5S-RMF15干涉載體已經(jīng)引發(fā)了轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)，抑制了BcMF15基因的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化植

9、株花器官的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化植株的雄蕊表現(xiàn)為花絲短小，花藥不飽滿、發(fā)白，花粉量少．花粉萌發(fā)試驗(yàn)和花粉形態(tài)電鏡掃描表明，pBI35S-RMF15菜心轉(zhuǎn)基因植株花粉的萌發(fā)率為35.94％，明顯低于相應(yīng)的空載體對(duì)照(74.40％)，存在顯著差異。這表明轉(zhuǎn)BcMF15干涉載體引發(fā)了RNAi沉默效應(yīng)，抑制了BcMF15的表達(dá)，影響正?；ǚ劢Y(jié)構(gòu)的形成，從而使花粉形狀發(fā)生改變，導(dǎo)致花粉畸形。樹(shù)脂半薄切片和透射電鏡相結(jié)合觀察轉(zhuǎn)基因植株花蕾的發(fā)育過(guò)程，

10、發(fā)現(xiàn)在中蕾階段-約小孢子發(fā)育單核靠邊期，絨氈層提前降解，而使花粉發(fā)生敗育。因此我們推測(cè)BcMF15編碼的LTP基因作用于花藥細(xì)胞中，通過(guò)影響花藥在花粉發(fā)育過(guò)程中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化等代謝活動(dòng)，從而影響絨氈層的發(fā)育，進(jìn)而對(duì)小孢子發(fā)育過(guò)程中花粉壁的形成、花粉的萌發(fā)及花粉管的伸長(zhǎng)產(chǎn)生影響。 (5)利用TAIL-PCR方法首次克隆了BcMF15基因的啟動(dòng)子pBc15。序列分析表明，該序列A+T的比例為61.61％，C

11、+G的比例為38.39％，符合啟動(dòng)子的堿基組成。對(duì)ATG上游的5'-UTR(5'-untranslated region)序列用Blast軟件在GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)上作同源搜索發(fā)現(xiàn)，這段序列與大白菜(Brassica rapa subsp．pekinensis)基因組DNA的同源性為99％。使用三個(gè)重要的植物啟動(dòng)子順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其中的功能元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：BcMF15基因的5-UTR不僅含有啟動(dòng)子特有元件如TATAbox和35S

12、啟動(dòng)子持有元件GATA box，而且還具有多個(gè)調(diào)控花粉發(fā)育特異表達(dá)的功能元件，如GGTT和GTGA元件以及番茄lat52/LeMAN5激活花粉特異表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，POLLEN1LELAT52元件。此外還存在多個(gè)環(huán)境誘導(dǎo)的序列元件，說(shuō)明了BcMF15基因的5'-UTR序列可能是一個(gè)花粉發(fā)育特異的調(diào)控序列，同時(shí)受光和干旱等脅迫因子的誘導(dǎo)。 (6)成功構(gòu)建了帶有GUS報(bào)告基因的嵌合啟動(dòng)子載體pBI-pBc15，并通過(guò)基因槍將其轉(zhuǎn)化到洋