白菜雄性不育相關(guān)新基因BcMF1的克隆和功能驗證.pdf

1、蕓薹屬是十字花科植物的重要類群，也是我國栽培面積最大的蔬菜作物。白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino)是蕓薹屬蕓薹種的一個亞種，是典型的異花授粉作物，具有顯著的雜種優(yōu)勢，F(xiàn)1代雜種的推廣應(yīng)用可以提高白菜的生產(chǎn)水平。雄性不育材料在白菜F1代種子的生產(chǎn)中具有重要地位，其選育和利用日益受到人們的重視。以白菜雄性不育材料為基礎(chǔ)，分析雄性不育相關(guān)基因的表達特征，分離雄性不育相關(guān)基因并驗證基因的功

2、能，不僅可以促進白菜雄性不育材料的選育，而且對于揭示植物雄性不育的分子機制也具有重要的理論意義。 本文以‘矮腳黃’白菜隱性核雄性不育兩用系為研究對象，在前人獲得雄性不育相關(guān)新基因Brassica campestris Male Fertility 1(BcMF1)的cDNA拼接序列的基礎(chǔ)上，通過PCR進一步克隆BcMF1的DNA全長和cDNA全長；通過TAIL PCR技術(shù)克隆該基因的啟動子序列；對BcMF1及其啟動子的序列特征以

3、及編碼蛋白的功能進行分析和預(yù)測；并在幾種蕓薹屬植物中進行BcMF1同源基因的克隆和進化分析。為驗證BcMF1的功能，構(gòu)建了RNA干涉(RNAi)和反義RNA植物表達載體，在分析菜心BcMF1同源基因表達特征的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菜心植株，獲取BcMF1表達沉默的卡那霉素抗性植株，對轉(zhuǎn)基因植株的花粉發(fā)育狀態(tài)進行觀察，深入分析BcMF1在白菜花粉發(fā)育中的生物學(xué)功能。本研究獲得的主要結(jié)果如下： (1)根據(jù)表達差異片段BcMF-

4、A15T17及其RACE擴增序列設(shè)計引物，PCR擴增得到BcMF1準(zhǔn)確的cDNA全長和DNA全長序列，cDNA全長為1684 bp，基因全長為1985 bp，含有兩個內(nèi)含子和3個外顯子，最大開放閱讀框為1416 bp，預(yù)測該基因可編碼一個含有471個氨基酸的蛋白質(zhì)。不計算70 bp的3’末端A/T豐富序列和polyT尾部結(jié)構(gòu)，前人所得到的cDNA拼接序列為1613 bp，最大開放閱讀框為1344 bp，預(yù)期可編碼一個含有447個氨基酸的

5、蛋白質(zhì)。本文的結(jié)果校正了前人cDNA拼接序列及其預(yù)測的氨基酸序列的誤差。在GeneBank中沒有發(fā)現(xiàn)與BcMF1同源性較高的功能已知基因，BcMF1僅與擬南芥未知功能蛋白家族DUF1216的相似性較高，是第一個被報導(dǎo)的DUF1216表達基因，蛋白質(zhì)特征分析顯示BcMF1基因編碼蛋白很可能是一個定位在細胞外的分泌蛋白。 (2)以兩用系的可育株群和不育株群為研究對象，使用Northern雜交的方法較全面地分析了BcMF1的轉(zhuǎn)錄表達特

6、征，結(jié)果顯示BcMF1僅在可育株系的中花蕾、大花營、花以及雄蕊中特異表達，在不育株系中不表達。因此，BcMF1是一個與白菜育性相關(guān)的新基因。 (3)通過PCR在不育株中擴增了BcMF1序列，通過TAIL PCR在兩用系可育株和不育株中同時擴增了該基因的啟動子序列，從DNA水平上探討該基因表達差異形成的分子機理。序列比對發(fā)現(xiàn)BcMF1及其啟動子序列在可育株和不育株中沒有出現(xiàn)變異，表明該基因的這種表達差異不是因為基因或啟動子序列突變

7、所引起的，推測BcMF1的表達受其他基因的調(diào)控。在BcMF1啟動子序列中，發(fā)現(xiàn)了一些與光誘導(dǎo)響應(yīng)、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，推測BcMF1的表達可能受到光條件、內(nèi)外源激素以及逆境脅迫的影響 (4)根據(jù)BcMF1的全長序列設(shè)計引物，在7種蕓薹屬蔬菜作物中克隆到BcMF1的同源序列，BcMF1同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分別為97.8％～99.6％和95.3％～98.9％。以同源基因的多序列比對為基礎(chǔ)，對7種蕓

8、薹屬蔬菜作物的BcMF1同源基因進行系統(tǒng)分析，揭示了BcMF1同源基因在這些蔬菜作物中的進化關(guān)系。 (5)克隆了菜心BcMF1同源基因并分析其表達特征，證明了菜心適用于白菜BcMF1的功能分析。構(gòu)建了RNA干涉表達載體pBcMF1-RNAi和反義RNA表達載體pBcMF1-AS，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菜心，獲得了Kan抗性菜心植株。分子檢測表明已得到了BcMF1-AS轉(zhuǎn)基因植株和BcMF1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株，Northern雜交顯示

9、BcMF1的表達在轉(zhuǎn)基因植株中受到抑制。對轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況、花器官發(fā)育、花粉形態(tài)、花粉離體萌發(fā)率以及花粉發(fā)育過程進行觀察，發(fā)現(xiàn)抑制BcMF1的表達可以影響菜心植株的花粉發(fā)育，因此推論BcMF1是一個與白菜花粉發(fā)育相關(guān)的新基因。 (6)根據(jù)pBI121質(zhì)粒多克隆位點兩側(cè)的DNA序列設(shè)計一對通用引物，以幾種pBI121表達載體及其轉(zhuǎn)基因植株為模板進行PCR擴增，并使用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切分析來驗證擴增條帶的真實性，檢測結(jié)果