紅豆杉及菊科植物中萜類單體化合物抗肺癌活性篩選及其作用機制研究.pdf

1、第一部分、萜類化合物抗肺癌活性篩選
　　 萜類化合物紫杉醇(Taxol(R))是美國學者Dr. Wall最早于1971年從太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹皮中分離得到的萜類抗腫瘤活性成分，1992年美國FDA批準了紫杉醇用于卵巢癌的治療，1994年又批準其用于乳腺癌的治療，此后，紫杉醇很快應用于多種常見惡性腫瘤，并取得了顯著的療效，成為抗癌的主要明星藥物，引起了腫瘤界的極大關注和期望。但是，紫杉醇取自紅豆杉的

2、樹皮，紅豆杉全世界僅有11種，分布范圍狹窄，生長極為緩慢，加上紫杉醇在樹皮中的含量很低，這就大大地限制了紫杉醇的開發(fā)利用。為此，本實驗對多種植物來源的萜類化合物進行了抗肺癌活性篩選，目的是尋找有效的植物來源抗癌成分，以緩解紫杉醇對環(huán)境資源的破壞以及紫杉醇來源受限的局面。
　　 目的：為了緩解紫杉醇供不應求的局面，尋找到活性更強毒性更小的化合物，本研究對東北紅豆杉和加拿大紅豆杉可再生針葉中提取純化得到的16種非紫杉醇二萜類化合物為

3、對象，對人肺腫瘤細胞增殖抑制活性進行了篩選，并進行了腫瘤細胞增殖抑制活性和結構之間構-效關系的探討。同時為了擴大藥源，篩查更多的有效抗癌成分，本研究還對來自菊科植物中的18種倍半萜類化合物進行了抗肺癌腫瘤細胞的活性篩選。
　　 方法：應用MTT比色法進行活性篩選。細胞接種于96孔板，每孔含1×104個細胞，分別加入溶劑對照(終濃度0.1％DMSO)、陽性對照順鉑和各種實驗用化合物，終濃度為100μmol/L、10μmol/L和1

4、μmol/L，每組設3復孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結束前4h，各培養(yǎng)孔加入5mg/mL MTT10μL。實驗終止測定各孔吸光度值(OD值)，測定波長λ=570nm，參考波長λ=630nm，并計算細胞增殖抑制率或存活率。細胞增殖抑制率(％)=（1-給藥組OD值/對照組OD值）×100;細胞存活率(％)=（給藥組OD值/對照組OD值）×100;實驗用化合物對腫瘤細胞的濃度-效應曲線用Hill數(shù)學模型擬合，

5、計算實驗用化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。
　　 結果：34種萜類化合物抑制人肺腫瘤細胞的增殖活性的篩選結果為：二萜類化合物taxinine(3)對實驗用五種人肺腫瘤細胞的增殖均有較強的抑制活性，其中對A549細胞的增殖抑制率在濃度為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L時分別為23.81％，60.40％和90.18％；2α，10β-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin11(12)

6、和taxuspine A(16)除對RERF-LC-KJ細胞外的四種人肺腫瘤細胞的增殖均有較強的抑制活性，其中化合物12對A549細胞的增殖抑制率在濃度為1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L時分別為18.31％，48.73％和68.19％；化合物16對A549細胞的增殖顯示較強的抑制活性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為9.54μmol/L。倍半萜內酯類化合物17（異土木香內酯）、22（澤蘭內酯）、23(3β，9β-diace

7、toxyiβ,10α-epoxy-11α,13-dihydrocostunolide)、29(achillinin A)和30(dehydrocostuslactone)對三種人非小細胞肺腫瘤細胞的增殖均顯示較強的抑制活性，化合物32(dihydrodehydro-costuslactone)對QG-56細胞的增殖抑制率為90.75％;化合物22、23、29和30對人小細胞肺癌PC-6細胞的增殖均顯示較強的抑制活性，化合物17、22、2

8、3、29和30對人小細胞肺癌QG-90細胞的增殖顯示較強的抑制活性。
　　 小結：從東北紅豆杉和加拿大紅豆杉中提取的3種二萜類化合物和從菊科植物中提取的5種倍半萜類化合物對人肺腫瘤細胞具有較強的增殖抑制活性；人肺腫瘤細胞的增殖抑制活性不僅與紫杉烷類化合物的骨架結構密切關系，而且該類化合物的抑制人肺腫瘤細胞增殖活性可能還與C-5位具有的肉桂?；鶄孺溍芮邢嚓P。
　　 第二部分、異土木香內酯體內外抗癌活性及構-效關系研究

9、>　　 菊科植物在我國資源豐富，富含倍半萜類化學成分，其結構類型多，具有多種生物活性。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本，從土木香中提取的單體化合物異土木香內酯，具有抗結核、抗炎和抗腫瘤的效果。
　　 目的：為較系統(tǒng)地研究異土木香內酯的抗腫瘤活性，并探討異土木香內酯抗瘤活性與結構的關系，本實驗室采用體外培養(yǎng)的人小細胞肺腫瘤細胞株和人非小細胞肺腫瘤細胞株以及人多種其他器官由來的腫瘤細胞株對從土

10、木香的根中純化的六種倍半萜內酯化合物進行了體外增殖抑制實驗。為探討其對正常細胞的毒性作用，應用MTT法對正常倉鼠肺成纖維細胞（CHL）抗增殖活性進行觀察，并構造裸鼠人肺癌A549移植性腫瘤模型，觀察異土木香內酯體內抗瘤活性及對體重和免疫器官脾的影響。
　　 方法：采用MTT比色法觀察異土木香內酯對人多器官由來的腫瘤細胞及CHL的增殖抑制活性，具體方法與第一部分相同。利用人肺腺癌細胞A549裸鼠移植瘤動物模型，檢測異土木香內酯體內

11、抗人肺癌的效果。選取6-8周齡，體重18-22g之間雌性裸鼠，接種人肺腺癌細胞A549于裸鼠右前腋下，1周后腫瘤平均達6×6mm，隨機分為5組，每組6只。空白對照組：按照0.1mL/10g體重腹腔注射生理鹽水。陽性對照組：給予順鉑干預，2mg/kg體重給藥，連續(xù)腹腔注射7天。實驗組為異土木香內酯，灌胃給藥，分為實驗低劑量組：1mg/kg體重給藥；實驗中劑量組：10mg/kg體重給藥；實驗高劑量組：100mg/kg體重給藥；連續(xù)給藥10天

12、。于給藥后12天脫頸處死裸鼠，迅速剝離瘤塊及脾臟，稱重記錄。按照公式：腫瘤抑瘤率=（1-給藥組平均瘤重/空白對照組平均瘤重）×100％，計算藥物抑瘤率。按照公式：脾指數(shù)=平均脾重/平均體重×1000，計算脾指數(shù)。
　　 結果：異土木香內酯作用于人肺癌細胞株，具有較強的抗細胞增殖作用，對人非小細胞肺癌細胞A549和QG-56增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.01μmol/L和9.39μmol/L，對人小細胞肺腫瘤細胞(PC-

13、6和QG-90)的增殖抑制作用與陽性對照順鉑相同，與空白對照組比較有顯著差異(p＜0．05)。異土木香內酯對人腦神經(jīng)膠質瘤細胞U251SP細胞增殖的IC50為10.55μmol/L，對人肝癌細胞株HLE和人黑色素瘤細胞株MM1-CB細胞的增殖均顯示明顯抑制作用，化合物2-Hydroxy-11，13-dihydroxy-isoalantolactone(20)、11α,13-Dihydroxyisoal anto-lactone(21)、

14、2α-hydroxy11α,13-dihydroisoalantolactone(25)、britannila ctone(27)和1-O-acetylbritannilactone(28)對本實驗用細胞的增殖不顯示抑制活性，IC50均大于100μmol/L。用100μmol/L異土木香內酯處理CHL細胞，對其增殖的抑制率為46.33％,異土木香內酯對CHL的IC50大于100μmol/L。
　　 體內抗人肺癌裸鼠模型實驗，于實

15、驗結束后處死裸鼠剝取瘤重，稱取體重?？瞻讓φ战M平均體重27.5g，平均瘤重0.53g；陽性對照順鉑組平均體重為26.5g，平均瘤重0.42g；異土木香內酯高劑量組（100mg/kg）、中劑量組（10mg/kg）、低劑量組(1mg/kg)平均體重分別為26.6g、27.0g和27.2g；平均瘤重分別為0.38g、0.44g和0.47g。抑瘤率分別為：順鉑組20.8％，實驗藥物高劑量組為28.3％，中劑量組為17％，低劑量組為11.4％。各

16、組的裸鼠模型脾指數(shù)分別為：空白對照組5.81，順鉑組3.37，異土木香內酯高劑量組5.19，中劑量組6.51，低劑量組5.12。
　　 小結：異土木香內酯具有明顯的抗多種惡性腫瘤細胞增殖活性，并具有濃度依賴性；異土木香內酯具有明顯的體內抗瘤活性，一定濃度下其抑瘤效果優(yōu)于順鉑，并對體重和脾臟沒有明顯的損傷作用；異土木香內酯對倉鼠肺成纖維細胞的增殖抑制作用低于順鉑；異土木香內酯活性與其具有的α，β-不飽和五員內酯環(huán)的結構有關，不飽和

17、的環(huán)外雙鍵氫化飽和后形成飽和五員內酯環(huán)，可能是抗腫瘤活性消失或減弱的原因，A-環(huán)開環(huán)可能是導致其體外抑制腫瘤細胞增殖作用消失或減弱的另一原因。
　　 第三部分、異土木香內酯抗肺癌作用機制研究
　　 離體和在體實驗均已證明，許多抗癌藥物均可對不同類型的敏感瘤細胞誘導凋亡，臨床上應用的放療、熱療以及一些生物治療的目的也主要是引發(fā)細胞凋亡。中國傳統(tǒng)藥物中最近發(fā)現(xiàn)很多成分具有抗瘤作用，并且報道發(fā)現(xiàn)，這些成分多通過誘導細胞凋亡而發(fā)

18、揮作用?；诖?，本實驗對異土木香內酯的抗瘤活性機制進行了研究。
　　 目的：在發(fā)現(xiàn)異土木香內酯對肺癌細胞具有明顯抗增殖活性的基礎上，首先對其是否引起肺癌細胞凋亡進行了研究，并對其作用于腫瘤細胞引起的細胞因子變化進行了探討，以明確異土木香內酯的抗肺癌活性機制。
　　 方法：1．吖啶橙(acridine orange，AO)染色觀察凋亡形態(tài)變化。用終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L異土木香內酯處理A

19、549細胞，48h后棄去培養(yǎng)液，滴加吖啶橙工作染液染色，熒光顯微鏡下用紫藍光激發(fā)濾片，觀察，拍照。2．流式細胞術(flow cytometry, FCM)觀察異土木香內酯作用A549細胞后凋亡情況和細胞周期變化。用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細胞，1×106個，三枚加入異土木香內酯，終濃度為20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L，一枚為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，胰酶消化后收集細胞，加入10％雞紅細胞作為內參標準，與樣

20、品同步染色，加入碘化丙啶一步插入DNA熒光染色，以500目銅網(wǎng)過濾，采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行DNA檢測。3．DNA Ladder技術觀察凋亡DNA片段。用直徑60mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細胞，3×105個，一枚為對照組，三枚加入異土木香內酯，終濃度為5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集全細胞，細胞裂解液裂解細胞后用酚氯仿法提取DNA，1％瓊脂

21、糖凝膠電泳，50V，2h。DNR MiniBIS Pro照相系統(tǒng)拍照。4．Western Blotting技術觀察異土木香內酯作用肺癌細胞后7種蛋白因子Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP、Akt、P53及P21變化。用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)A549細胞，1×106個，一枚為對照組，一枚加入順鉑，終濃度為20μmol/L，四枚加入異土木香內酯，終濃度為5μmol/L、10μ.mol/L、20μmol/L和40μmol/L。

22、化合物作用人肺癌細胞48h后，收集全細胞。裂解細胞后，聚丙烯凝膠電泳，牛奶封閉，轉膜，依次與一抗和二抗孵育，化學發(fā)光，顯影。5．利用MTT法，檢測了半胱天冬酶抑制劑對異土木香內酯抑制人肺癌細胞增殖的翻轉作用。使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的異土木香內酯處理A549細胞，加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與土木香內酯共同孵育48h后，MTT法測定OD值。
　　 結果：1．吖啶橙染色顯

23、示，經(jīng)異土木香內酯作用后的A549細胞，細胞數(shù)目減少，核染色質濃縮，細胞膜皺縮，并形成凋亡小體。2．經(jīng)異土木香內酯處理A549細胞后，與對照組相比，凋亡峰隨濃度升高而逐漸增加，異土木香內酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L濃度時凋亡細胞比率分別為0.85％、0.82％、6.59％和15.32％。細胞周期分析顯示，隨異土木香內酯濃度升高，G1期細胞數(shù)隨之升高，其他各期細胞數(shù)隨之降低，異土木香內酯在0μm

24、ol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L濃度時處于G1期細胞比率分別為33.4％、37.7％、57.3％和60.2％。3．異土木香內酯處理A549細胞后48h，瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)濃度在10μmol/L和20μmol/L時出現(xiàn)DNA梯狀條帶，并呈濃度依賴性。4．異土木香內酯在濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L時處理A549細胞，48h后Akt、HSP90α無明顯變化，Caspase

25、-3、Bax、P53和P21隨藥物濃度增加而增加，Bcl-2則隨濃度降低，其中p53和p21具有時間依賴性，p53和p21在異土木香內酯內酯作用于A549細胞后12h、24h、48h逐漸升高。5．使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的異土木香內酯處理A549細胞，其細胞生存率分別為81.01％、31.03％、22.00％和13.96％，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與土木香內酯共同孵育A54

26、9細胞后，其細胞生存率分別上升為93.34％、68.76％、74.80％和70.14％，且20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑可顯著翻轉異土木香內酯對A549細胞增殖的抑制作用。
　　 小結：1異土木香內酯通過誘導人肺腺癌A549細胞凋亡而發(fā)揮抗瘤活性，并使細胞停滯在G1期。2異土木香內酯通過p53通路發(fā)揮抗人肺腺癌A549活性，使p53增高，順次促使p21升高，作用于Cdk，使細胞停滯在G1期；p53促進Bax增高，Bcl-2抑

27、制，進一步引起Caspase-3增高，引起細胞凋亡。各蛋白因子的變化都具有濃度依賴性，p53和p21具有時間依賴性。3異土木香內酯對人肺腺癌A549抗瘤活性機制與紫杉醇不同，紫杉醇使A549細胞停滯在M期。4異土木香內酯抗人肺腺癌A549機制與PI3K/Akt通路無關，與HSP90α無關。
　　 結論：1.三種二萜類化合物及五種倍半萜類化合物對人肺腫瘤細胞的增殖有較強的抑制活性，其活性與結構有一定關系。2.異土木香內酯具有明顯的