基于化合物篩選技術(shù)對(duì)SAHA衍生物的合成、抗肺癌活性和作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases。HDACs）能夠在機(jī)體內(nèi)起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵作用。大量的研究表明其異常調(diào)節(jié)與腫瘤有著直接和密切的聯(lián)系，所以研制和開發(fā)越來越多針對(duì)HDACs抑制作用的HDAC抑制劑（Histone deacetylases inhibition。HDACi），促使機(jī)體的乙?；接兴?，從而達(dá)到治療更多類型實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤的前景。按照結(jié)構(gòu)類型的差異，HDAC抑制劑可分為：異羥肟酸類

2、、苯甲酰胺類、環(huán)肽類、親電酮類等不同藥效基團(tuán)的小分子抑制劑，其中HDACi是通過哪些作用機(jī)制使腫瘤細(xì)胞死亡，目前為止關(guān)于這方面的研究較為透徹和深入，例如，增加細(xì)胞的凋亡性死亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化程度，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期的阻滯作用，觸發(fā)細(xì)胞自身發(fā)生自噬的作用，減少細(xì)胞的遷移能力和新血管的生成等等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。隨著全球新增癌癥患者的增加和世界對(duì)于新藥開發(fā)節(jié)奏的加快，自2006年10月，在美國(guó)上市的SAHA作為世界上第一用于抑制HD

3、AC的抗腫瘤藥物，研發(fā)不同類別HDACi和衍生物成為當(dāng)今新藥開發(fā)的主流方向，特別是抗癌藥物的市場(chǎng)隨著人民生活水平而急速擴(kuò)大?，F(xiàn)有的HDACi由于靶標(biāo)性和亞型選擇性不強(qiáng)的原因，就會(huì)造成無選擇性地對(duì)一些生理性的HDAC產(chǎn)生作用，從而產(chǎn)生額外的副作用和毒性。由于近年來空氣污染等環(huán)境因素，肺癌的發(fā)生率急劇上升，診斷和治療具有很大的難度，同時(shí)也是全球關(guān)注的熱門和重點(diǎn)攻克的難題。
　　研究目的：本課題首先通過對(duì)SAHA母體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)和原子相互

4、作用力的分析基礎(chǔ)上，對(duì)表面識(shí)別區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾設(shè)計(jì)，得到新的系列SAHA衍生物，并優(yōu)化合成技術(shù)路線和結(jié)構(gòu)鑒定，然后，進(jìn)行體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)、靶點(diǎn)HDACs作用實(shí)驗(yàn)和分子模擬對(duì)接論證，以篩選出作用效果理想和或毒性低的目標(biāo)衍生物，同時(shí)，觀察其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬作用，以及初步探討凋亡和自噬信號(hào)通路的分子機(jī)制，為后期的研發(fā)工作提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：通過對(duì)混合酸酐法反應(yīng)路徑和溶劑的優(yōu)化，合成多個(gè)SAHA衍生物，對(duì)粗產(chǎn)物采用聯(lián)合CH2C

5、l2、利用硅膠柱分離原理等多種方法進(jìn)行純化并用液相進(jìn)行純度的鑒定。在衍生物的結(jié)構(gòu)方面，(MS-ESI+)、13C-NMR、1H-NMR和IR四種常用的方法進(jìn)行鑒定。體外活性評(píng)價(jià)采用CCK-8方法，設(shè)置7個(gè)化合物濃度組，考察衍生物對(duì)多株肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的抗增殖活性以及毒性作用，篩選出效果較為理想的化合物作為候選。同時(shí)從計(jì)算機(jī)分子模擬方面進(jìn)行理論上的驗(yàn)證，使用軟件AutoDock6.0對(duì)衍生物和作用靶點(diǎn)HDAC8的結(jié)合力進(jìn)行測(cè)定，另外對(duì)結(jié)

6、合力較強(qiáng)化合物的各個(gè)作用力參數(shù)深入的測(cè)定（包括：靜電相互作用、氫鍵相互作用、疏水相互作用、范德華力相互作用）。另外使用Elisa法，設(shè)置5個(gè)化合物濃度組，對(duì)總HDAC抑制活性進(jìn)行測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫法（Elisa）對(duì)相關(guān)的凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2）和自噬通路蛋白（Beclin-1）進(jìn)行正反向地檢測(cè)和研究。采用透射電鏡觀察衍生物是否能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬體的自噬現(xiàn)象。采用裸鼠皮下異種移植方法，評(píng)價(jià)其裸鼠

7、體內(nèi)的抗肺癌效果，以及觀察其對(duì)心、肝、脾、肺和腎重要臟器的影響。通過Bliss法測(cè)定衍生物昆明小鼠腹腔注射給藥的LD50值，考察其急性毒性作用。
　　研究結(jié)果：優(yōu)化混合酸酐法反應(yīng)路徑和條件后，成功地合成A系列化合物（N34、N4I、N4B、N24），其產(chǎn)率得到了較大的提高（56.3％~72.5%），完成了相關(guān)的結(jié)構(gòu)鑒定（MS-ESI+、13C-NMR、1H-NMR和IR）和純度鑒定（>95%）。在系列A化合物體外抗肺癌細(xì)胞的研究中

8、，均能表現(xiàn)出對(duì)肺癌細(xì)胞株較好的抗增殖效果，對(duì)正常細(xì)胞的毒性小，與陽(yáng)性藥物SAHA對(duì)比，N34和N4I對(duì)SPC-A-1細(xì)胞株的藥效強(qiáng)且敏感，其中N34的IC50=0.9678μM為SAHA的1/4之多，呈現(xiàn)良好的構(gòu)效關(guān)系。對(duì)總HDAC抑制活性的篩選中，在SPC-A-1細(xì)胞株中N34的IC50=0.04379μM，達(dá)到納摩爾級(jí)別。通過計(jì)算機(jī)分子模擬與受體HDAC8的作用力測(cè)試中，N34與晶體內(nèi)部的氨基酸殘基結(jié)合表現(xiàn)最為突出，其自由能、靜電能

9、和氫鍵作用力等均比SAHA強(qiáng)。對(duì)相關(guān)凋亡和自噬的蛋白研究中，N34能明顯提升Beclin-1、Caspase-3，Caspase-9蛋白表達(dá)的水平，在下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平的同時(shí)，抑制Caspase凋亡途徑的信號(hào)通路后，可以較為明顯地觀察到Beclin-1蛋白水平的上調(diào)。B系列衍生物（N3F、N2E）的體外實(shí)驗(yàn)中，N3F同樣能夠較好地抑制肺癌細(xì)胞株（SPC-A-1）的增殖，且影響正常細(xì)胞的增殖方面較少。B系列化合物N3F和N2E的小鼠腹

10、腔注射LD50分別是183.7501mg/kg（95%置信區(qū)間為118.3983 mg/kg≤LD50≤285.1738 mg/kg）和312.7871mg/kg（95%置信區(qū)間為165.0207≤LD50≤592.8696）。在藥效評(píng)價(jià)和篩選中，選用皮下移植異種的荷瘤裸鼠，采用灌胃給藥方式，15天后對(duì)腫瘤體積和重量、裸鼠體重和臟器分配系數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示高、中劑量的N3F能夠明顯地抑制肺癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，且能將抑瘤率提升到50%以上；

11、給藥期間，各組荷瘤裸鼠均存活，體重均有不同程度的下降，隨劑量的減少，體重減少越多，高劑量組對(duì)體重影響比SAHA的小，在臟器分配系數(shù)中，僅肝臟的分配系數(shù)增大，說明其存在一定的毒副作用。通過透射電子顯微鏡的觀察，能看到N3F誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬的現(xiàn)象。
　　研究結(jié)論：針對(duì)SAHA為母體，對(duì)其表面識(shí)別區(qū)進(jìn)行修飾，成功地得到系列衍生物（N34、N4I、N43、N24），并通過對(duì)混合酸酐法中所需的試劑和反應(yīng)條件的優(yōu)化進(jìn)行合成，其產(chǎn)率得到明顯

12、改善，說明該優(yōu)化后的合成路徑較為理想。A系列化合物對(duì)多株肺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的抗增殖作用，其中N34對(duì)SPC-A-1細(xì)胞株的作用尤為突出，其作用強(qiáng)度和對(duì)靶點(diǎn)HDACS作用分別是SAHA的4倍多和10倍多，對(duì)正常細(xì)胞的毒性小，呈現(xiàn)良好的構(gòu)效關(guān)系；分子對(duì)接也證實(shí)了其晶體內(nèi)部氨基酸殘基的結(jié)合能力表現(xiàn)最為突出，自由能、靜電能和氫鍵作用力等均比SAHA強(qiáng)；有顯著的上調(diào)自噬蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的作用。N3F對(duì)多株肺癌細(xì)胞增殖和裸鼠皮下肺癌荷瘤生長(zhǎng)均有