東北紅豆杉(Taxus cuspidata)中非紫杉醇類化合物抑制婦科腫瘤細胞增殖活性及其作用機制的研究.pdf

1、目的：自從20世紀70年代美國化學(xué)家Wani等從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中提取一種針狀結(jié)晶物質(zhì)——紫杉醇（Taxol），特別是發(fā)現(xiàn)此物質(zhì)對癌細胞具有顯著的抑制作用以來，國內(nèi)外許多學(xué)者把精力投入到對該屬植物的化學(xué)成分分析和生理活性的研究上來，并對其進行開發(fā)利用。近年來，人們已從該屬植物中分離得到紫杉烷二萜、生物堿等化學(xué)成分。其中，尤以紫杉烷類成分研究較多。本實驗旨在研究東北紅豆杉中非紫杉醇類化合物對體外培養(yǎng)的人

2、子宮頸癌細胞株（HeLa）、人子宮內(nèi)膜癌細胞株（HEC-1）、人卵巢透明癌細胞株（SHIN-3）、人卵巢透明癌細胞株（HOC-21）和人卵巢囊腺癌細胞株（HAC-2）增殖的抑制作用，并初步探討其抑制細胞增殖的作用機制。
　　 方法：
　　 1.腫瘤細胞株懸液制備
　　 用RPMI1640完全培養(yǎng)液將HeLa等腫瘤細胞株調(diào)整為濃度2×105個細胞/mL的細胞懸液備用。
　　 2.四甲基偶氮唑藍（MTT）比色

3、法
　　 將腫瘤細胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50μL（含1×104個細胞），分別加入空白對照磷酸鹽緩沖液、溶劑對照0.05％二甲基亞砜和陽性對照紫杉醇以及1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L單體化合物各50μL，每組均設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入MTT10μL。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入反應(yīng)停止液150μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光

4、度（OD）值。每個實驗均重復(fù)3次。
　　 3.Annexin V-FIFC/PI雙染流式細胞術(shù)
　　 細胞傳代進入對數(shù)生長期，實驗組加入50μmol/L的2-Deacetoxytaxinine J，空白對照組加入磷酸鹽緩沖液，于培養(yǎng)48 h后收集細胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞兩次，用250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)整其濃度為1×106/mL，取100μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5μLAnnexin V/FI

5、TC和10μL，20μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加400μL稀釋后的結(jié)合緩沖液，及時上流式細胞儀分析。每次實驗均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果：
　　 1.四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法結(jié)果顯示：
　　 1.1以1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的Compound1處理HEC-1細胞48 h后，其生存率分別為95.87％、60.74％和37.92％，并呈現(xiàn)較好的

6、劑量依賴關(guān)系，其中10Hmol/L和100μmol/L濃度組與空白對照相比均有顯著性差異（P<0.01）；以100μmol/L的Compound1處理HeLa、SHIN-3、HOC-21和HAC-2細胞48 h后，其生存率分別為26.93％、52.43％、55.07％和42.32％，對細胞增殖顯示較強的抑制活性，與空白對照組相比，均有非常顯著性的差異（P<0.01）。其中Compound1對HeLa和HEC-1細胞的增殖顯示較強的抑制活

7、性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別約為51.33μmol/L和32.52μmol/L，100μmol/L組與空白對照組相比均具有非常顯著性的差異（P<0.01）。
　　 1.2以100μmol/L的Compound2處理HeLa和HEC-1細胞48 h后，其生存率分別為70.29％和69.73％，與空白對照組相比，具有非常顯著性的差異（P<0.01）；以10μmol/L和100μmol/L的Compound2處理HAC-2細胞，

8、其生存率分別為87.48％和67.30％，100μmol/L組與空白對照組相比，具有顯著性差異（P<0.05）；Compound2用1μmol/L、10μmol/L和10μmol/L處理細胞，其生存率為86.84％、86.99％和69.36％，對SHIN-3細胞增殖顯示較弱的抑制活性。
　　 1.3以100μmol/L的Compound3處理HeLa、HOC-21和HAC-2細胞48 h后，其生存率分別為64.61％、67.31

9、％和，60.47％，對細胞增殖顯示較強的抑制活性，與空白對照組相比，具有非常顯著性的差異（P<0.01）；用100μmol/L的Compound3處理HEC-1細胞，其生存率為69.23％，對HEC-1細胞增殖顯示較弱的抑制活性，與空白對照組相比，具有顯著性的差異（P<0.05）；Compound3用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L處理細胞48 h后，其生存率為88.58％、84.82％和70.75％，對SHIN-3

10、細胞增殖顯示較弱的抑制活性，10μmol/L和100μmol/L濃度組與空白對照組相比，具有非常顯著性差異（P<0.01）。
　　 2.Annexin.V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果
　　 以50μmol/L的Compound1處理HeLa細胞，結(jié)果顯示HeLa細胞早期凋亡率為（48.51±6.84）％，PBS組為（3.47±3.82）％，Compound1的50μmol/L濃度組與PBS組相比，具有顯著性差異（P<0.

11、05）。流式細胞檢測進～步證實2-Deacetoxytaxinine J具有明顯誘導(dǎo)HeLa細胞發(fā)生凋亡的活性，與MTT結(jié)果相符。
　　 結(jié)論：
　　 1.東北紅豆杉中三種非紫杉醇類化合物在體外對HeLa、HEC-1、SHIN-3、HOC-21和HAC-2細胞增殖有不同的抑制活性。其中2-Deacetoxytaxinine J對HeLa和HEC-1細胞的增殖顯示較強的抑制活性。
　　 2.東北紅豆杉中非紫杉醇類化