靶向抑制GLUT-1及PI3K-Akt信號通路提高喉癌放射敏感性體外研究.pdf

1、目的:
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)GLUT-1表達(dá)與喉癌Hep-2細(xì)胞的放射抵抗中有一定相關(guān)性，然而喉癌放射抵抗的真正機(jī)制尚不清楚，可能是多種因素相互作用的結(jié)果，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，隨著對GLUT-1調(diào)節(jié)因素的了解，研究發(fā)現(xiàn)一些信號通路參與其中，如磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinese/protein kinase B，PI3K/Akt)。因此抑制GLUT-1表達(dá)及PI3K/Akt

2、信號通路，以提高惡性腫瘤放射敏感性越來越受到廣大臨床研究者的關(guān)注。
　　PI3K/Akt信號通路通過生長因子與受體結(jié)合而激活。激活的PI3K/Akt信號通路促使細(xì)胞生長、生存和分化。在一些惡性腫瘤如胰腺癌，頭頸部癌，肺癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，其激活與許多癌癥的化、放療抵抗密切相關(guān)。激活的PI3K/Akt信號通路產(chǎn)生放射抵抗的主要機(jī)理在于內(nèi)在放射抵抗性;而外界因素包括放射治療后腫瘤細(xì)胞增生及缺氧

3、，后者往往導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞GLUT-1表達(dá)增高。因此我們認(rèn)為PI3K/Akt信號通路的激活極有可能是通過惡性腫瘤細(xì)胞GLUT-1表達(dá)增高而產(chǎn)生放射抵抗，通過對PI3K/Akt信號通路調(diào)控GLUT-1表達(dá)影響惡性腫瘤放射敏感性。
　　本研究，我們再次檢測放射前后喉癌細(xì)胞GLUT-1的表達(dá)情況，明確喉癌放射抵抗與GLUT-1表達(dá)增高有關(guān);用SiRNA干擾靶向抑制GLUT-1的表達(dá)，并研究LY294002、wortmannin和apig

4、enin等抑制劑阻滯PI3K/Akt信號通路，以降低喉癌細(xì)胞中GLUT-1表達(dá)，明確喉癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路調(diào)控GLUT-1表達(dá)對喉癌放射敏感性的影響及機(jī)制，為將來臨床喉癌患者喉功能保留治療提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　SiRNAGLUT-1瞬間轉(zhuǎn)染后通過熒光定量PCR及Western blot篩選出于擾效果最佳的SiRNAGLUT-1。將Hep-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染SiRNAGLUT-1、LY294002、w

5、ortmannin、apigenin和不同放射劑量通過不同組合分成30個(gè)組，通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成率、實(shí)時(shí)RT-PCR檢測GLUT-1mRNA的表達(dá)、Westernblotting檢測各組Hep-2細(xì)胞中GLUT-1、PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、通過熒光定量PCR及Western blot篩選出干擾效果最佳的SiRNAGLUT-1為GLUT-1siRNA803。
　　2、各組細(xì)胞

6、克隆形成率(％)與對照組(CK)組比較，隨照射劑量的增大克隆形成降低(p＜0.05); apigenin、 LY294002、wortmannin能協(xié)同SiRNAGLUT-1增強(qiáng)X線對喉癌Hep-2細(xì)胞照射敏感性(p＜0.05)。
　　3、SiRNAGLUT-1能抑制GLUT-1mRNA的表達(dá)，apigenin能協(xié)同SiRNAGLUT-1的抑制作用(p＜0.05)，分別用X線4Gy、6Gy、8Gy照射后，apigenin能明顯抑制

7、喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1mRNA的表達(dá)(p＜0.05)，同樣apigenin協(xié)同SiRNAGLUT-1能減低喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1mRNA的表達(dá)(p＜0.05);LY294002協(xié)同SiRNAGLUT-1能減低喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1mRNA的表達(dá)(p＜0.05);而無論在對照組、X線照射組wortmannin均并不能抑制喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1mRNA的表達(dá)(p＞0.05)，在X線照射情況下，wort

8、mannin也不能協(xié)同SiRNAGLUT-1減低喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1mRNA的表達(dá)(p＞0.05)。
　　4、(1)各種治療對喉癌Hep-2細(xì)胞中GLUT-1蛋白表達(dá)的影響SiRNA、50μM apigenin、5μM wortmannin、10μM LY294002分別單獨(dú)作用于喉癌Hep-2細(xì)胞時(shí)，對GLUT-1蛋白的表達(dá)變化與對照組的表達(dá)均無差異(p＞0.05)，50μ M apigenin以及10μM LY29

9、4002分別聯(lián)合SiRNA作用喉癌Hep-2細(xì)胞時(shí)GLUT-1蛋白的表達(dá)較對照組下降，差異有顯著性(p值分別為0.047，0.034)，而5μM wortmannin聯(lián)合SiRNA作用喉癌Hep-2細(xì)胞時(shí)GLUT-1蛋白的表達(dá)與對照組的表達(dá)無差異(p＞0.05)。
　　4Gy、6Gy、8Gy分別照射喉癌Hep-2細(xì)胞后GLUT-1蛋白的表達(dá)與對照組無差異(p＞0.05)，4Gy、6Gy、8Gy分別照射喉癌Hep-2細(xì)胞后，GLUT

10、-1蛋白表達(dá)各組之間無差異(p＞0.05)。
　　4Gy、6Gy、8Gy分別照射Hep-2細(xì)胞時(shí)，分別用50μ M apigenin、5μMwortmannin、10μ MLY294002或者分別聯(lián)合SiRNA時(shí)（分別與4Gy、6Gy、8Gy照射組比較），對GLUT-1的表達(dá)均無明顯的抑制作用(p＞0.05)。
　　(2)各種治療對喉癌Hep-2細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)的影響
　　與對照組相比，SiRNA能降低喉癌Hep

11、-2細(xì)胞中的PI3K蛋白的表達(dá)(p=0.012)，50μ M apigenin聯(lián)合SiRNA作用喉癌Hep-2細(xì)胞時(shí)PI3K蛋白的表達(dá)下降，差異有顯著性(p=0.026)，其余各組對PI3K的表達(dá)與對照組相比無差異(p＞0.05)。
　　4Gy照射組，除10μM LY294002作用于喉癌Hep-2細(xì)胞后PI3K蛋白的表達(dá)與4Gy照射組有差異(p=0.007)，其余各組對PI3K的表達(dá)與4Gy照射組相比無差異(p＞0.05)。

12、r>　　6Gy照射Hep-2細(xì)胞時(shí)，分別用50μM apigenin、5μM wortmannin、10μM LY294002或者分別聯(lián)合SiRNA時(shí)（分別與6Gy照射組比較），對PI3K的表達(dá)均無明顯的抑制作用(p＞0.05)。
　　(3)各種治療對喉癌Hep-2細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)的影響
　　與對照組相比，5μ M wortmannin聯(lián)合SiRNA能降低喉癌Hep-2細(xì)胞中的p-Akt蛋白的表達(dá)(p=0.038)，

13、其余各組對p-Akt的表達(dá)與對照組相比無差異(p＞0.05)。
　　4Gy、6Gy、8Gy照射組，分別用50μM apigenin、5μM wortmannin、10μM LY294002或者分別聯(lián)合SiRNA時(shí)（分別與4Gy、6Gy、8Gy照射組比較），對p-Akt蛋白的表達(dá)均無明顯的抑制作用(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　apigenin、LY294002、wortmannin能協(xié)同SiRNAGLUT-1增強(qiáng)X