硫化氫后處理激活線粒體ATP敏感性鉀通道和PI3K-Akt保護缺血大鼠心肌.pdf

1、目的： 硫化氫是一種內(nèi)源性氣體信號分子，可以在半胱氨酸代謝過程中通過心血管系統(tǒng)胱硫醚-γ-裂解酶的作用下內(nèi)源性合成。研究表明硫化氫預處理對缺血再灌注心肌有確切的保護作用。硫化氫后處理對缺血再灌注心肌是否有保護作用，以及其保護作用的內(nèi)源性機制有待于研究。本實驗用大鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注模型和培養(yǎng)心肌細胞缺氧復氧模型，從器官、細胞、線粒體、分子水平研究硫化氫后處理對缺血再灌注心肌的作用。本實驗的目的：(1)探討再

2、灌注早期給予硫化氫處理是否能減輕心肌缺血再灌注損傷；(2)探討硫化氫后處理心肌保護作用機制是否與線粒體ATP敏感性鉀通道開放有關；(3)研究P13K/Akt/GSK3β信號通路是否參與了硫化氫和處理的心肌保護作用機制；(4)探討硫化氫后處理誘導線粒體ATP敏感性鉀通道開放和P13K/Akt/GSK3β激活對線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)是否有調(diào)節(jié)作用。 方法： 1、再灌注早期硫化氫后處理保護心肌免受再灌注損傷 所有離

3、體灌注的大鼠心臟經(jīng)受30分鐘缺血和90分鐘再灌注。后處理方式：再灌注即刻給予4次15秒缺血或含硫氫化鈉的灌注液處理間隔15秒含氧灌注液灌注。48只大鼠隨機分入以下6組，每組8只：缺血/再灌注(CON)、缺血后處理組(Pcon)；0.1μmol/L硫氫化鈉后處理組(NP0.1)；1μmol/L硫氫化鈉后處理組(NP1)；10μmol/L，硫氫化鈉后處理組(NP10)；100μmol/L，硫氫化鈉后處理組(NP100)。觀察各組血流動力學指

4、標、冠脈漏出液肌酸激酶、乳酸脫氫酶釋放和心肌梗死面積變化。 2、硫化氫后處理中線粒體ATP敏感性鉀通道的作用 灌注方案同實驗一。大鼠隨機分為7組，每組8只：0.2％dimethy1 sulfoxide(DMSO)溶劑對照組(Vehicle)；缺血再灌注對照組(CON)；1μmol/L硫化氫后處理組(NP1)；100μmol/L 5-羥葵酸拮抗NP1組(5-HD+NP1)；10μmol/L格列本脲拮抗NP1組(Gli+NP

5、1)；100μmol/L 5-羥葵酸組(5-HD)；10μmol/L格列本脲組(Gli)。觀察各組血流動力學指標、冠脈漏出液肌酸激酶、乳酸脫氫酶釋放和心肌梗死面積變化。 3、硫化氫后處理中PI3K-Akt-GSK3β信號通路的作用 缺血再灌注方案同實驗一。大鼠隨機分入以下5組，每組8只：0.2％DMSO溶劑對照組(Vehicle)；缺血再灌注對照組(CON)；1μmol/L硫化氫后處理組(NP1)、15μmol/L的LY

6、294002拮抗NP1組(LY+NP1)；15μmol/L的LY294002溶于0.02％DMSO組(LY)觀察各組心臟心功能、酶學、心肌梗死面積指標，免疫組化和Western blot檢測磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的表達。 4、硫化氫后處理中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道的作用 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)后經(jīng)受2小時缺氧2小時復氧復制缺氧/復氧模型。同批培養(yǎng)的心肌細胞隨機分入以下6組：(CON)缺氧／復氧組；(NPl)1μmol/L硫

7、氫化鈉后處理組；(NPl+5-HD)1μmol/L硫氫化鈉后處理+100μmol/L的5羥葵酸組；(NP1+LY) 1μmol/L硫氫化鈉后處理+15μmol/L的LY294002組；(LY)15μmol/L的LY294002組；(5-HD)100μmol/L的5-HD組。檢測各組細胞存活率、線粒體游離鈣、線粒體活性氧、線粒體膜電位、線粒體通透性轉(zhuǎn)換、線粒體胞漿細胞色素C含量和線粒體電鏡分析。 5、統(tǒng)計學分析 所有計量資

8、料數(shù)據(jù)用(-x±s)表示。SPSS13.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較用單因素方差分析，SNK檢驗。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、硫化氫后處理保護大鼠心肌免受再灌注損傷 再灌注60和90分鐘，Peon(69±5,66±7mmHg)，NP0.1(65±6,63±5mmHg)，NP1(67±6,65+7 mmHg)，NP10(61±5，60±6mmHg)各組的LVDP分別顯著高于缺血再灌注CON組(48

9、±8，43±6 mmHg)(均P<0.05)；Peon心肌梗塞面積(21.7 ±6.2％)低于CON(47.6±5.3％，P<0.05)。與CON比較，0.1-10gμmol/L硫氫化鈉后處理各組劑量依賴性減少心肌梗塞面積(NP0.1，34.2 ±5.1％，NP1，23.4 ±4.6％,NP10，25.1 ±7.2％，P<0.05與CON組比較)，而100μmol/L NaHS未能減少梗死面積。與CON比較，Peon明顯抑制了冠脈漏出液

10、中CK、LDH的釋放(均P<0.05)；NP0.1、NPl、NP10也劑量依賴性抑制了CK、LDH的釋放(均P<0.05)。 2、硫化氫后處理開放ATP敏感性鉀通道保護心肌 根據(jù)實驗一量效關系結(jié)果，選擇1μmol/L的NaHS為后處理代表性硫化氫后處理劑量，進一步研究鉀通道阻斷劑是否能拮抗硫氫化鈉的心肌保護作用。結(jié)果顯示，10μmol/L格列苯脲和100μmol／L的5-HD均拮抗了NP1組減少心肌梗塞面積的保護作用(G

11、li+NPl，46.5±8.6％；5-HD+NPl，42.0±10.3％，P<0.05與NPl組比較，23.4 ±4.6％)。再灌注早期給與10 μmol／L格列苯脲或100μmol／L 5-HD均能拮抗硫化氫后處理再灌注60、90分鐘提高LVDP的作用(均P

12、比較，NP1組心肌梗塞面積(23.4±7.2％)明顯小于CON(47.6±5.3％，P<0.05)；NP1明顯抑制冠脈漏出液CK，LDH的釋放(均P<0.05)。NP1組顯著提高了磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3β(Ser9)的表達(均P<0.05)。151μmol/L的LY294002拮抗了硫化氫后處理減少心肌梗塞面積的作用，LY+NP1組(44.5±6.7％)梗死面積高于NPl組(23.4±7.2％，P<0.05)。L

13、Y294002拮抗了NP1組限制心肌CK、LDH釋放的保護作用(均P<0.05)。同時LY+NP1組的磷酸化Akt(Ser473)和磷酸化GSK-3β(Ser9)的表達顯著低于NP1組(均P<0.05)。 4、硫化氫后處理激活ATP敏感性鉀通道和P13K-Atk-GSK-3β信號 最終抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換缺氧復氧末NP1組心肌細胞存活率高于CON(49.1±3.8％vs 31.9±4.1％，P<0.05)；線粒體游離鈣濃

14、度低于CON(424.3±14.7 vs 712.8±18.4 nmol/mg．pro，P<0.05)；線粒體活性氧產(chǎn)生速率低于CON(8.1±0.6 vs 13.2±0.7 fluorescenceunits/sec．mg．pro，P<0.05)；線粒體膜電位TMRE熒光相對值高于CON(73.6±4.5％vs51.6±6.1％，P<0.05)；Calcein熒光相對值高CON(提示抑制了線粒體通透性轉(zhuǎn)換)(61.7±7.5％Vs 3

15、9.4±5.2％，P<0.05)，增加了線粒體細胞色素C的含量保存(p<0.05)，減少了胞漿細胞色素C的釋放(p<0.05)，保存了線粒體超微結(jié)構(gòu)完整。100μmol/L的5-HD完全拮抗了NP1組以上保護效果(均P<0.05)。15μmol/L的LY294002拮抗了NP1組在細胞存活率以及線粒體膜電位、MPTP方面、細胞色素C釋放的保護作用(均P<0.05)，而未能拮抗NP1組對線粒體鈣、活性氧的抑制作用。 結(jié)論：

16、 (1)硫化氫后處理能夠保護缺血再灌注大鼠心臟免受再灌注損傷。其保護作用體現(xiàn)在：抑制線粒體游離鈣超載和線粒體活性氧的產(chǎn)生，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生，提高復氧心肌細胞膜電位，保護線粒體超微結(jié)構(gòu)的完整，減少線粒體細胞色素C的釋放。最終提高復氧細胞存活率，減少心肌梗塞面積，提高再灌注心肌收縮功能。 (2)硫化氫后處理心肌保護機制包括線粒體ATP敏感性鉀通道的開放。 (3)硫化氫后處理激活線粒體．ATP敏感性鉀通道開放，抑制線