PI3K-Akt和JNK信號(hào)通路與AfMNPV誘導(dǎo)斜紋夜蛾SL-1細(xì)胞凋亡.pdf

1、細(xì)胞凋亡是由胞內(nèi)基因控制的程序死亡過(guò)程，即多細(xì)胞生物在生理或病理?xiàng)l件下，經(jīng)過(guò)多途徑的信號(hào)傳導(dǎo)作用而啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制，結(jié)束其自身生命的過(guò)程。目前人們對(duì)于細(xì)胞凋亡途徑的研究已經(jīng)進(jìn)行了一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，由于細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞周期、增殖分化與凋亡以及多種生命活動(dòng)中的重要調(diào)節(jié)作用亦愈來(lái)愈受人重視，因此關(guān)于細(xì)胞凋亡與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的關(guān)系的研究也相繼開(kāi)展起來(lái)。JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的一重要分支，或稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，它在細(xì)胞周期、凋

2、亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用;PI3K信號(hào)通路通過(guò)參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)尤其是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活而受到人們的重視，其中AKT也稱為蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效應(yīng)物，活化的AKT通過(guò)磷酸化多種酶、激酶或轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。
　　關(guān)于以上所述的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系的研究基本是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中展開(kāi)，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的研究，前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡

3、的過(guò)程中涉及到線粒體凋亡途徑，細(xì)胞色素C從胞間質(zhì)釋放到胞質(zhì)中后引起下游的一系列復(fù)雜的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)之上，探究JNK和PI3K-AKT信號(hào)通路與AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的過(guò)程間是否也存在某種聯(lián)系。
　　SP600125和Wortmannin分別是JNK和PI3K-AKT信號(hào)通路的特異性抑制劑，實(shí)驗(yàn)之前我們對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞SL-1進(jìn)行了兩種抑制劑的耐受性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SP600125和Wortmannin在濃度低于50μ

4、M時(shí)，對(duì)SL-1的生長(zhǎng)基本無(wú)毒害用。首先為了更好地了解SL-1細(xì)胞在各種條件下的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)中采用血細(xì)胞板法計(jì)數(shù)細(xì)胞，繪制它的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下的SL-1細(xì)胞成簡(jiǎn)單的“S型”生長(zhǎng)，當(dāng)分別加入這兩種最適濃度的抑制劑SP600125(2.5μM)和Wortmannin(0.5μM)培養(yǎng)細(xì)胞后，SL-1的生長(zhǎng)趨勢(shì)不變，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的抑制劑也是采用這兩種濃度。在熒光顯微鏡下從形態(tài)學(xué)上定性的觀察DAPI染色的SL-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)

5、經(jīng)SP600125和Wortmannin分別處理的AfMNPV誘導(dǎo)后的SL-1細(xì)胞，凋亡小體明顯減少;流式細(xì)胞術(shù)定量的測(cè)量細(xì)胞凋亡率的結(jié)果與之一致，抑制劑組的細(xì)胞凋亡程度明顯較病毒組低，因此初步可以判定JNK和PI3K信號(hào)通路參與了AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的過(guò)程。
　　接下來(lái)研究采用caspase-3酶活的測(cè)定以及Western Blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，試圖探究JNK和PI3K-AKT信號(hào)通路如何影響AfMNP

6、V誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡后，caspase-3酶活增強(qiáng)且被活化切割成17KD片段，啟動(dòng)了下游的凋亡事件，但是當(dāng)分別或同時(shí)加入抑制劑SP600125和Wortmannin后，caspase-3的切割大幅度減弱，凋亡程度明顯被抑制，其中同時(shí)使用兩種抑制劑的效果和單獨(dú)使用抑制劑時(shí)區(qū)別不大。于是對(duì)凋亡上游事件細(xì)胞色素C的變化情況進(jìn)行檢測(cè)，和預(yù)測(cè)結(jié)果一致，在加入抑制劑SP600125和Wortma

7、nnin后胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量顯著下降，這就說(shuō)明在AfMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的起始階段，JNK和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即被活化參與到整個(gè)凋亡進(jìn)程中。
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)編碼JNK的基因jnk1、jnk2、jnk3，其相應(yīng)的編碼產(chǎn)物JNK1和JNK2廣泛存在于各組織中，當(dāng)JNK通路被激活，相應(yīng)的蛋白JNK1和JNK2會(huì)發(fā)生磷酸化進(jìn)而發(fā)揮功能。當(dāng)用免疫印跡雜交的方法檢測(cè)JNK1/2和PI3K的關(guān)鍵效應(yīng)物AKT蛋白的表達(dá)情況，

8、發(fā)現(xiàn)AfMNPV是通過(guò)磷酸化JNK1/2和AKT來(lái)分別激活了JNK和PI3K-AKT信號(hào)通路并且影響了SL-1細(xì)胞周期，但是所有這些蛋白的磷酸化程度在分別加入SP600125和Wortmannin后相應(yīng)的減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論是被活化切割的caspase-3蛋白還是JNK和PI3K信號(hào)通路的效應(yīng)物P-JNK1/2和P-AKT，蛋白含量都隨病毒誘導(dǎo)凋亡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
　　因此初步可以得出結(jié)論，JNK和PI3K-AKT信號(hào)通路通過(guò)