脂肪間充質(zhì)干細胞移植治療高動力性肺動脈高壓的實驗研究.pdf

1、背景：高動力性肺動脈高壓是左向右分流型先天性心臟病的常見并發(fā)癥，嚴重影響患者外科手術(shù)治療時機，手術(shù)成功率及手術(shù)后的生存質(zhì)量。有關(guān)肺動脈高壓形成的機理和治療研究已經(jīng)取得了很大進展，現(xiàn)已明確肺動脈高壓是以肺血管阻力進行性升高和肺血管阻塞性病變?yōu)樘卣鞯膼盒苑窝懿?，特征性的病理改變?yōu)榉涡用}中膜增生肥厚，最終導致肺小動脈的閉塞，肺血管床減少，使增高的肺動脈壓力更高，肺功能嚴重惡化。左向右分流型先天性心臟病引起的肺動脈高壓，在經(jīng)過手術(shù)矯治心內(nèi)畸

2、形后，部分病例可以緩解，但是肺血管的阻塞性病變一旦發(fā)生，卻是手術(shù)不能恢復的。單純擴血管治療肺動脈高壓，在一定程度上降低了肺動脈壓力，改善了病人的生活質(zhì)量，但對于肺血管的破壞性病變其療效有限。近年來，治療性血管新生成為醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點，干細胞的應用更是組織工程的重點研究對象。脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞是一種來源于脂肪可以向中胚層多種細胞誘導分化的多能干細胞，因其取材簡單，創(chuàng)傷小，少量脂肪組織即可獲取大量細胞，體外培養(yǎng)方便，擴增容易而倍受

3、研究者的關(guān)注。而且體外研究指出ADSCs(Adipose Derived Stromal Cells，ADSCs)可以分泌大量的促血管新生的細胞因子如肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等。HGF是一種高效的血管生成因子，對多種組織器官的損傷起到修復作用，以往的多項研究將ADSCs用于缺血性疾病取得了

4、滿意的結(jié)果，更有研究將該種細胞用于肺損傷模型，如肺氣腫的動物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌的HGF的作用增加肺組織的血管及腺泡的生成和修復，從而改善了肺組織的血流灌注和換氣功能。因此我們設(shè)想：在肺動脈高壓的情況下利用自體ADSCs增加肺組織的血管生成，增加肺組織的灌注，對進行性惡化的肺血管進行修復，改善肺功能。從而為這種破壞性疾病尋求一種有效的治療方式，目前，將脂肪間充質(zhì)干細胞用于肺動脈高壓的研究尚未見報道。
　　

5、 目的：建立大鼠的動力性肺動脈高壓模型，體外分離培養(yǎng)大鼠自體ADSCs并進行有效標記，經(jīng)靜脈途徑移植細胞到肺組織，觀察大鼠肺動脈壓力變化及肺血管的病理變化，分析ADSCs移植后與肺動脈壓力變化之間的關(guān)系，同時檢測肺組織HGF的表達情況，為ADSCs移植后對肺動脈高壓的影響尋求可能的解釋。
　　 方法：⑴以大鼠為研究對象，行大鼠頸動脈-頸靜脈套管法分流手術(shù)，分別在手術(shù)后4周，8周，12周，通過心臟血管超聲進行無創(chuàng)檢查，檢測分流血

6、管是否通暢，測量大鼠的肺動脈瓣環(huán)內(nèi)徑和主動脈瓣環(huán)內(nèi)徑，肺動脈血流頻譜測量計算肺動脈血流加速時間，心臟超聲探測右心室前壁和左心室后壁厚度，計算厚度指數(shù)，并行心尖四腔超聲觀察右心室的變化，有創(chuàng)檢查包括經(jīng)右心導管及開胸測量大鼠的肺動脈壓力。動物處死后肺組織行病理形態(tài)學分析，計算各組動物肺小血管的肌化血管的百分比，血管壁厚度指數(shù)和相對血管面積指數(shù)，從病理學角度觀察肺血管的病變，確定是否成功建立肺動脈高壓模型。⑵取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎后用膠原

7、酶消化，反復過濾離心獲取ADSCs，體外培養(yǎng)觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀鑒定不同代細胞的免疫表型，并用不同條件的培養(yǎng)基誘導細胞向脂肪細胞，骨細胞及內(nèi)皮細胞分化，通過油紅染色，堿性磷酸酶染色及Ⅷ因子免疫熒光鑒定其多向分化功能。不同代數(shù)的細胞傳代時進行臺盼蘭染色測定細胞活力，MTT法測定體外培養(yǎng)的不同代數(shù)細胞的生長曲線，計算細胞倍增時間。酶聯(lián)免疫吸附法測定常氧和低氧條件下體外培養(yǎng)的大鼠ADSCs分泌的HGF含量，CM-DiL標記細胞并傳代觀察其

8、標記效率，同時對標記后的細胞進行MTT活力檢測以揭示該染料對細胞活力的影響。⑶將大鼠頸動靜脈分流手術(shù)后12周處死的動物模型資料作為基線水平，另有造模12周的動物分為空白對照組，細胞移植組，DMEM組作為陽性對照組，僅作血管分離的假手術(shù)組作為陰性對照組。細胞移植組經(jīng)非手術(shù)側(cè)頸靜脈給予含5×107個自體ADSCs的培養(yǎng)基，DMEM組僅給予不含細胞的培養(yǎng)基注射，空白對照組為造模12周后的動物不給予任何處理。細胞移植2周后，行超聲多普勒檢查，右

9、心導管肺動脈測壓。處死動物后行肺組織病理檢查，冰凍組織切片行免疫熒光檢查，觀察移植到體內(nèi)的ADSCs在肺組織的分布，并鑒定其在體內(nèi)是否繼續(xù)分泌HGF。免疫組織化學檢測ADSCs移植后的HGF含量，Ⅷ因子染色進行肺小血管計數(shù)，觀察細胞移植后對肺血管數(shù)量的影響。Western Blot及RT-PCR測定各組動物肺組織HGF含量及細胞移植后eNOS的表達變化。
　　 結(jié)果：①分流手術(shù)中因麻醉過量或出血死亡10只，死亡率為13.4％(1

10、0/60)，手術(shù)后因套管脫落及其他原因死亡4只，手術(shù)后死亡率為8％(4/50)，超聲及解剖發(fā)現(xiàn)分流手術(shù)后存活的46只大鼠有10只動物血管橋阻塞，2只血管橋套管不明原因丟失，從分流組排除，分流通暢率73.9％(34/46)。大鼠頸動靜脈分流12周后，超聲顯示肺動脈瓣環(huán)內(nèi)徑(3.52±0.27mm)明顯大于主動脈瓣環(huán)內(nèi)徑(2.99±0.32m，P<0.05)。肺動脈血流頻譜顯示肺動脈血流加速時間(75.31±22.12 ms)較正常對照組(

11、135.14±26.42ms)及分流4周(119.38±12.81 ms)，8周時(106.56±31.45 ms)縮短，右心室游離壁與左心室后壁的厚度比值計算分析顯示分流12周后(63.02±14.36％)比正常對照組(41.08±4.54％)及4周(40.46±13.41％)，8周時(42.24±5.87％)明顯增大，P<0.05，心尖四腔圖提示分流12周后右心室擴大，收縮期室間隔左向偏移；以上結(jié)果間接反映了手術(shù)后肺動脈壓力的升高。

12、右心導管及開胸測壓顯示分流組動物的肺動脈收縮壓(37.69±7.81 mmHg)較正常對照組(16.59±4.51mmHg)升高，P<0.05。病理學檢查發(fā)現(xiàn)分流12周后，肺組織小動脈管壁增厚，管腔狹窄，肺小動脈的管壁厚度指數(shù)(34.25±9.11％)，及管壁面積指數(shù)(69.72±13.19％)均比正常對照組(分別為16.71±4.99％，29.05±9.79％)明顯增高，P<0.05。②大鼠腹股溝脂肪組織經(jīng)過膠原酶消化后，72小時細胞

13、貼壁，成纖維細胞樣生長，原代細胞分離種植后7-10天融合至80％左右可以傳代，傳代后細胞生長旺盛，約3-5天即可再次傳代。流式細胞儀測定細胞表面免疫表型，原代細胞CD29，CD105，SCa-1陽性率較高，CD31陽性率稍高，CD45基本陰性，傳代2次后細胞CD31基本陰性，其余表型變化不大。油紅染色鑒定成脂誘導7天后的細胞可見細胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，堿性磷酸酶染色鑒定成骨誘導14天的ADSCs，細胞變長，聚集，細胞漿可見棕紅色的鈣化沉積

14、顆粒，Ⅷ因子染色顯示細胞漿內(nèi)呈陽性表達。MTT測定細胞的生長曲線顯示不同代的細胞生長旺盛，貼壁24-60小時達到倍增時間，72小時后到達平臺期。細胞傳代時臺盼蘭染色測定細胞傳代15次以內(nèi)的活力均在90％以上。酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞上清HGF的含量顯示：低氧條件下培養(yǎng)的細胞其上清液中HGF含量明顯高于常氧條件下培養(yǎng)的細胞，而且細胞代數(shù)越低，細胞上清液中HGF的含量越高。CM-DiL標記細胞后進行熒光觀察顯示細胞標記率高達99％以上，而且進

15、行多次傳代后熒光無明顯淬滅。標記后的P2代細胞MTT活性檢測發(fā)現(xiàn)與正常未標記的細胞生長曲線相似，沒有明顯差異。③大鼠自體ADSCs移植后2周，超聲檢查發(fā)現(xiàn)肺動脈血流加速時間比造模后未行任何治療的空白對照組延長(129.58±35.14毫秒VS80.49±21.29毫秒，P<0.05)，心尖四腔圖顯示右心室室腔減小，收縮期室間隔的左向偏移消失，右心室前壁與左心室后壁的厚度比值較空白對照組明顯減小(42.63±8.71％VS59.39±7.

16、12％，P<0.05)。右心導管及開胸測量肺動脈壓力顯示細胞移植組的肺動脈壓力(19.83±2.32mmHg)較空白對照組的肺動脈壓力(35.82±5.09 mmHg)降低，P<0.05。熒光顯微鏡下觀察細胞移植后的肺組織冰凍切片顯示移植的細胞大部分聚集在肺血管周圍，但是移植的細胞沒有形成明顯的環(huán)狀血管樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光化學分析顯示移植到體內(nèi)的ADSCs仍然表達HGF，免疫組織化學檢測表明細胞移植組的肺組織HGF表達高于空白對照組及DME

17、M組，RT-PCR及Western Blot也提示細胞移植后增加了肺組織HGF的mRNA及蛋白表達。同時RT-PCR及Western Blot檢測eNOS的表達顯示在細胞移植后eNOS的mRNA及蛋白表達與HGF的變化相一致。Ⅷ因子進行的血管染色分析顯示細胞移植后肺小血管明顯增多，單位面積內(nèi)的血管數(shù)量大于空白對照組及DMEM組。
　　 結(jié)論：⑴大鼠頸動脈-頸靜脈套管法分流手術(shù)12周后，血管通路保持通暢可以形成三尖瓣前型動力性肺動

18、脈高壓。手術(shù)后12周肺血管的變化符合肺動脈高壓的病理特征。⑵從大鼠腹股溝脂肪組織可以成功分離獲取ADSCs。該細胞在形狀，表型特征及多向分化的性能方面符合干細胞的標準。細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下生長旺盛，多次傳代后細胞活力不減。低氧條件下培養(yǎng)的ADSCs較常氧條件下培養(yǎng)的細胞分泌更多的HGF。CM-DiL標記ADSCs效率高，多次傳代后熒光不減，可以作為細胞移植示蹤的良好標記物。⑶ADSCs移植減輕了肺動脈高壓動物模型的肺動脈壓力，逆轉(zhuǎn)了惡化