脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓是左向右分流型先天性心臟病的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者外科手術(shù)治療時(shí)機(jī)，手術(shù)成功率及手術(shù)后的生存質(zhì)量。有關(guān)肺動(dòng)脈高壓形成的機(jī)理和治療研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，現(xiàn)已明確肺動(dòng)脈高壓是以肺血管阻力進(jìn)行性升高和肺血管阻塞性病變?yōu)樘卣鞯膼盒苑窝懿?，特征性的病理改變?yōu)榉涡?dòng)脈中膜增生肥厚，最終導(dǎo)致肺小動(dòng)脈的閉塞，肺血管床減少，使增高的肺動(dòng)脈壓力更高，肺功能嚴(yán)重惡化。左向右分流型先天性心臟病引起的肺動(dòng)脈高壓，在經(jīng)過(guò)手術(shù)矯治心內(nèi)畸

2、形后，部分病例可以緩解，但是肺血管的阻塞性病變一旦發(fā)生，卻是手術(shù)不能恢復(fù)的。單純擴(kuò)血管治療肺動(dòng)脈高壓，在一定程度上降低了肺動(dòng)脈壓力，改善了病人的生活質(zhì)量，但對(duì)于肺血管的破壞性病變其療效有限。近年來(lái)，治療性血管新生成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，干細(xì)胞的應(yīng)用更是組織工程的重點(diǎn)研究對(duì)象。脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來(lái)源于脂肪可以向中胚層多種細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多能干細(xì)胞，因其取材簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，少量脂肪組織即可獲取大量細(xì)胞，體外培養(yǎng)方便，擴(kuò)增容易而倍受

3、研究者的關(guān)注。而且體外研究指出ADSCs(Adipose Derived Stromal Cells，ADSCs)可以分泌大量的促血管新生的細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等。HGF是一種高效的血管生成因子，對(duì)多種組織器官的損傷起到修復(fù)作用，以往的多項(xiàng)研究將ADSCs用于缺血性疾病取得了

4、滿意的結(jié)果，更有研究將該種細(xì)胞用于肺損傷模型，如肺氣腫的動(dòng)物模型，依靠ADSCs的多向分化功能和/或其分泌的HGF的作用增加肺組織的血管及腺泡的生成和修復(fù)，從而改善了肺組織的血流灌注和換氣功能。因此我們?cè)O(shè)想：在肺動(dòng)脈高壓的情況下利用自體ADSCs增加肺組織的血管生成，增加肺組織的灌注，對(duì)進(jìn)行性惡化的肺血管進(jìn)行修復(fù)，改善肺功能。從而為這種破壞性疾病尋求一種有效的治療方式，目前，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于肺動(dòng)脈高壓的研究尚未見報(bào)道。
　　

5、 目的：建立大鼠的動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型，體外分離培養(yǎng)大鼠自體ADSCs并進(jìn)行有效標(biāo)記，經(jīng)靜脈途徑移植細(xì)胞到肺組織，觀察大鼠肺動(dòng)脈壓力變化及肺血管的病理變化，分析ADSCs移植后與肺動(dòng)脈壓力變化之間的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)肺組織HGF的表達(dá)情況，為ADSCs移植后對(duì)肺動(dòng)脈高壓的影響尋求可能的解釋。
　　 方法：⑴以大鼠為研究對(duì)象，行大鼠頸動(dòng)脈-頸靜脈套管法分流手術(shù)，分別在手術(shù)后4周，8周，12周，通過(guò)心臟血管超聲進(jìn)行無(wú)創(chuàng)檢查，檢測(cè)分流血

6、管是否通暢，測(cè)量大鼠的肺動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑和主動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑，肺動(dòng)脈血流頻譜測(cè)量計(jì)算肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間，心臟超聲探測(cè)右心室前壁和左心室后壁厚度，計(jì)算厚度指數(shù)，并行心尖四腔超聲觀察右心室的變化，有創(chuàng)檢查包括經(jīng)右心導(dǎo)管及開胸測(cè)量大鼠的肺動(dòng)脈壓力。動(dòng)物處死后肺組織行病理形態(tài)學(xué)分析，計(jì)算各組動(dòng)物肺小血管的肌化血管的百分比，血管壁厚度指數(shù)和相對(duì)血管面積指數(shù)，從病理學(xué)角度觀察肺血管的病變，確定是否成功建立肺動(dòng)脈高壓模型。⑵取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎后用膠原

7、酶消化，反復(fù)過(guò)濾離心獲取ADSCs，體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定不同代細(xì)胞的免疫表型，并用不同條件的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分化，通過(guò)油紅染色，堿性磷酸酶染色及Ⅷ因子免疫熒光鑒定其多向分化功能。不同代數(shù)的細(xì)胞傳代時(shí)進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色測(cè)定細(xì)胞活力，MTT法測(cè)定體外培養(yǎng)的不同代數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定常氧和低氧條件下體外培養(yǎng)的大鼠ADSCs分泌的HGF含量，CM-DiL標(biāo)記細(xì)胞并傳代觀察其

8、標(biāo)記效率，同時(shí)對(duì)標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行MTT活力檢測(cè)以揭示該染料對(duì)細(xì)胞活力的影響。⑶將大鼠頸動(dòng)靜脈分流手術(shù)后12周處死的動(dòng)物模型資料作為基線水平，另有造模12周的動(dòng)物分為空白對(duì)照組，細(xì)胞移植組，DMEM組作為陽(yáng)性對(duì)照組，僅作血管分離的假手術(shù)組作為陰性對(duì)照組。細(xì)胞移植組經(jīng)非手術(shù)側(cè)頸靜脈給予含5×107個(gè)自體ADSCs的培養(yǎng)基，DMEM組僅給予不含細(xì)胞的培養(yǎng)基注射，空白對(duì)照組為造模12周后的動(dòng)物不給予任何處理。細(xì)胞移植2周后，行超聲多普勒檢查，右

9、心導(dǎo)管肺動(dòng)脈測(cè)壓。處死動(dòng)物后行肺組織病理檢查，冰凍組織切片行免疫熒光檢查，觀察移植到體內(nèi)的ADSCs在肺組織的分布，并鑒定其在體內(nèi)是否繼續(xù)分泌HGF。免疫組織化學(xué)檢測(cè)ADSCs移植后的HGF含量，Ⅷ因子染色進(jìn)行肺小血管計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞移植后對(duì)肺血管數(shù)量的影響。Western Blot及RT-PCR測(cè)定各組動(dòng)物肺組織HGF含量及細(xì)胞移植后eNOS的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：①分流手術(shù)中因麻醉過(guò)量或出血死亡10只，死亡率為13.4％(1

10、0/60)，手術(shù)后因套管脫落及其他原因死亡4只，手術(shù)后死亡率為8％(4/50)，超聲及解剖發(fā)現(xiàn)分流手術(shù)后存活的46只大鼠有10只動(dòng)物血管橋阻塞，2只血管橋套管不明原因丟失，從分流組排除，分流通暢率73.9％(34/46)。大鼠頸動(dòng)靜脈分流12周后，超聲顯示肺動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑(3.52±0.27mm)明顯大于主動(dòng)脈瓣環(huán)內(nèi)徑(2.99±0.32m，P<0.05)。肺動(dòng)脈血流頻譜顯示肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間(75.31±22.12 ms)較正常對(duì)照組(

11、135.14±26.42ms)及分流4周(119.38±12.81 ms)，8周時(shí)(106.56±31.45 ms)縮短，右心室游離壁與左心室后壁的厚度比值計(jì)算分析顯示分流12周后(63.02±14.36％)比正常對(duì)照組(41.08±4.54％)及4周(40.46±13.41％)，8周時(shí)(42.24±5.87％)明顯增大，P<0.05，心尖四腔圖提示分流12周后右心室擴(kuò)大，收縮期室間隔左向偏移；以上結(jié)果間接反映了手術(shù)后肺動(dòng)脈壓力的升高。

12、右心導(dǎo)管及開胸測(cè)壓顯示分流組動(dòng)物的肺動(dòng)脈收縮壓(37.69±7.81 mmHg)較正常對(duì)照組(16.59±4.51mmHg)升高，P<0.05。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)分流12周后，肺組織小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，肺小動(dòng)脈的管壁厚度指數(shù)(34.25±9.11％)，及管壁面積指數(shù)(69.72±13.19％)均比正常對(duì)照組(分別為16.71±4.99％，29.05±9.79％)明顯增高，P<0.05。②大鼠腹股溝脂肪組織經(jīng)過(guò)膠原酶消化后，72小時(shí)細(xì)胞

13、貼壁，成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，原代細(xì)胞分離種植后7-10天融合至80％左右可以傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，約3-5天即可再次傳代。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面免疫表型，原代細(xì)胞CD29，CD105，SCa-1陽(yáng)性率較高，CD31陽(yáng)性率稍高，CD45基本陰性，傳代2次后細(xì)胞CD31基本陰性，其余表型變化不大。油紅染色鑒定成脂誘導(dǎo)7天后的細(xì)胞可見細(xì)胞漿內(nèi)脂滴染成紅色，堿性磷酸酶染色鑒定成骨誘導(dǎo)14天的ADSCs，細(xì)胞變長(zhǎng)，聚集，細(xì)胞漿可見棕紅色的鈣化沉積

14、顆粒，Ⅷ因子染色顯示細(xì)胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)。MTT測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示不同代的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，貼壁24-60小時(shí)達(dá)到倍增時(shí)間，72小時(shí)后到達(dá)平臺(tái)期。細(xì)胞傳代時(shí)臺(tái)盼蘭染色測(cè)定細(xì)胞傳代15次以內(nèi)的活力均在90％以上。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞上清HGF的含量顯示：低氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞其上清液中HGF含量明顯高于常氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞，而且細(xì)胞代數(shù)越低，細(xì)胞上清液中HGF的含量越高。CM-DiL標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行熒光觀察顯示細(xì)胞標(biāo)記率高達(dá)99％以上，而且進(jìn)

15、行多次傳代后熒光無(wú)明顯淬滅。標(biāo)記后的P2代細(xì)胞MTT活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常未標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相似，沒有明顯差異。③大鼠自體ADSCs移植后2周，超聲檢查發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間比造模后未行任何治療的空白對(duì)照組延長(zhǎng)(129.58±35.14毫秒VS80.49±21.29毫秒，P<0.05)，心尖四腔圖顯示右心室室腔減小，收縮期室間隔的左向偏移消失，右心室前壁與左心室后壁的厚度比值較空白對(duì)照組明顯減小(42.63±8.71％VS59.39±7.

16、12％，P<0.05)。右心導(dǎo)管及開胸測(cè)量肺動(dòng)脈壓力顯示細(xì)胞移植組的肺動(dòng)脈壓力(19.83±2.32mmHg)較空白對(duì)照組的肺動(dòng)脈壓力(35.82±5.09 mmHg)降低，P<0.05。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞移植后的肺組織冰凍切片顯示移植的細(xì)胞大部分聚集在肺血管周圍，但是移植的細(xì)胞沒有形成明顯的環(huán)狀血管樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光化學(xué)分析顯示移植到體內(nèi)的ADSCs仍然表達(dá)HGF，免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明細(xì)胞移植組的肺組織HGF表達(dá)高于空白對(duì)照組及DME

17、M組，RT-PCR及Western Blot也提示細(xì)胞移植后增加了肺組織HGF的mRNA及蛋白表達(dá)。同時(shí)RT-PCR及Western Blot檢測(cè)eNOS的表達(dá)顯示在細(xì)胞移植后eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)與HGF的變化相一致。Ⅷ因子進(jìn)行的血管染色分析顯示細(xì)胞移植后肺小血管明顯增多，單位面積內(nèi)的血管數(shù)量大于空白對(duì)照組及DMEM組。
　　 結(jié)論：⑴大鼠頸動(dòng)脈-頸靜脈套管法分流手術(shù)12周后，血管通路保持通暢可以形成三尖瓣前型動(dòng)力性肺動(dòng)

18、脈高壓。手術(shù)后12周肺血管的變化符合肺動(dòng)脈高壓的病理特征。⑵從大鼠腹股溝脂肪組織可以成功分離獲取ADSCs。該細(xì)胞在形狀，表型特征及多向分化的性能方面符合干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)旺盛，多次傳代后細(xì)胞活力不減。低氧條件下培養(yǎng)的ADSCs較常氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞分泌更多的HGF。CM-DiL標(biāo)記ADSCs效率高，多次傳代后熒光不減，可以作為細(xì)胞移植示蹤的良好標(biāo)記物。⑶ADSCs移植減輕了肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的肺動(dòng)脈壓力，逆轉(zhuǎn)了惡化