大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植治療實(shí)驗(yàn)性大鼠股動(dòng)脈閉塞癥的研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)利用特定的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及MSCs單獨(dú)或與必要的誘導(dǎo)因子組合移植治療實(shí)驗(yàn)性大鼠股動(dòng)脈閉塞癥，為臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足等血管閉塞性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．大鼠間充質(zhì)于細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定：選取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只，麻醉后在無(wú)菌的條件下取股骨和脛骨，骨剪剪斷關(guān)節(jié)處，用無(wú)血清DMEM沖出骨髓腔中的細(xì)胞后，用淋巴細(xì)胞分離

2、液(比重1.077g/ml)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，以含10﹪胎牛血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，以1×10<'7>cells/cm<'2>密度接種于培養(yǎng)瓶孵育。2天后半量換液，4天時(shí)完全換液，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3天換液1次，10天后當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，細(xì)胞傳至第4代后用流式細(xì)胞儀分析CD34、CD29的表達(dá)情況。 2．MsCs誘導(dǎo)分化：選取狀態(tài)較穩(wěn)定的

3、第4代細(xì)胞，分別用含10﹪胎牛血清和2﹪胎牛血清的誘導(dǎo)液(終濃度為10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天換液一次，細(xì)胞融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，于第7、14天用流式細(xì)胞儀分析CD34的表達(dá)情況，免疫組化法觀察FVⅢ的表達(dá)情況。 3．MSCs移植治療實(shí)驗(yàn)性大鼠股動(dòng)脈閉塞癥：選取0.2kg左右Wistar大鼠20只，其中的2只取雙下肢股四頭肌和腓長(zhǎng)肌做HE染色作為正常肌肉對(duì)照，剩余的18只

4、結(jié)扎并斷離雙側(cè)股動(dòng)脈，復(fù)制成大鼠股動(dòng)脈閉塞癥模型。模型中的6只大鼠分別在左側(cè)后肢局部缺血肌肉(股四頭肌和腓長(zhǎng)肌)通過(guò)多點(diǎn)注射的方法注射A液(生理鹽水)1 ml(A組)，按同樣的方法右側(cè)注射B液(培養(yǎng)擴(kuò)增后BrdU標(biāo)記的1×10<'6>cells/ml的MSCs懸液)1 ml(B組)；按同樣方法另外6只大鼠分別在左側(cè)注射C液(培養(yǎng)擴(kuò)增后BrdU標(biāo)記的1×10<'6>cells/ml的MSCs與100ng/mlVEGF+100ng/mlbF

5、GF誘導(dǎo)因子懸液)1ml(C組)，右側(cè)注射A液1ml(A組)；最后6只大鼠左側(cè)注射B液1ml(B組)，右側(cè)注射C液1ml(C組)。分別在移植的第7、14天處死大鼠，取雙下肢缺血部位肌肉做HE染色、免疫組織化學(xué)(FVⅢ、BrQU)檢測(cè)。 結(jié)果： 1．MSCs的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定：細(xì)胞接種4d后首次完全換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞即為MSCs，此細(xì)胞形態(tài)長(zhǎng)梭形，類似成纖維細(xì)胞，呈團(tuán)、簇狀分布。10d時(shí)細(xì)胞貼滿瓶底，此

6、時(shí)呈魚群樣、漩渦狀、輻射狀或網(wǎng)狀排列。傳代后細(xì)胞增殖迅速，一般2～3天可傳一代。流式細(xì)胞術(shù)分析MSCs結(jié)果顯示，CD34陽(yáng)性率為1.01±0.56﹪、CD29陽(yáng)性率為97.32±2.77﹪。 2．兩種誘導(dǎo)液誘導(dǎo)效果的比較：10﹪胎牛血清誘導(dǎo)體系，14d后免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FVⅢ的表達(dá)，細(xì)胞的陽(yáng)性率為12.21±2.32﹪；而2﹪胎牛血清誘導(dǎo)體系， 14d后檢測(cè)FVⅢ的表達(dá)，細(xì)胞的陽(yáng)性率為91.43±6.32﹪，后者明顯高于前者(

7、p<0.01)。 3.血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：經(jīng)2﹪胎牛血清誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)的MSCs分別于第7d、14d用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)法分析CD34和FVⅢ的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)表1。誘導(dǎo)后CD34和FVⅢ陽(yáng)性的細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形，但順應(yīng)性增加，呈鋪路石樣排列。表1．不同誘導(dǎo)時(shí)間CD34和FVⅢ的表達(dá)情況4．MSCs單獨(dú)或與必要的誘導(dǎo)因子組合血管再生作用比較：(1) 移植后7d免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，血管壁周圍B組和C組有BrdU陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而

8、A組無(wú)此細(xì)胞。(2) 移植后14d免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，肌束間B組、C組有BrdU陽(yáng)性的血管，而A組無(wú)BrdU陽(yáng)性的血管。(3) 平均每視野FVⅢ染色陽(yáng)性的血管數(shù)目：A組為2.8±0.6個(gè)/HP，B組為8.4±2.3個(gè)/HP，C組為12.6±2.9個(gè)/HP：B組明顯高于A組(p<0.01)，C組明顯高于B組(p<0.05)。 結(jié)論： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向本胚層縱向分化的潛