雷公藤紅素通過HIF-1α-Sema4D信號通路對乏氧誘導血管新生的抑制作用的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：研究雷公藤紅素(Celastrol)對乏氧誘導的腫瘤血管新生的影響，并探討其可能機制。
　　 方法：不同濃度的Celastrol處理乏氧條件下的血管內皮細胞株（EA.hy926)和腫瘤細胞株（HepG2和A549）6h或16h后，采用MTT法檢測Celastrol對乏氧條件下細胞增殖的影響；小管形成實驗及遷徙實驗檢測Celastrol對乏氧誘導的內皮細胞血管新生的影響；FITC-phalloidi

2、n及侵襲實驗檢測Celastrol對乏氧誘導的腫瘤細胞侵襲能力的影響；Real-time PCR檢測Celastrol對乏氧條件下軸突導向因子4D（Semaphorin 4D，Sema4D）mRNA表達的影響；Western blot及ELISA檢測Celastrol對乏氧條件下Sema4D膜型及分泌型蛋白表達的影響。
　　 結果：Celastrol抑制乏氧條件下血管內皮細胞(EA.hy926)及腫瘤細胞(A549和HepG2)

3、的增殖，干預6h后，IC50值分別為10.16±0.21，11.60±1.61，14.97±0.73μg/mL，作用時間延長至16h時，IC50值分別為6.54±0.30，4.32±0.45，5.66±0.51μg/mL，其抑制作用呈劑量和時間依賴性；乏氧可以誘導內皮細胞遷徙，乏氧干預16h后，透膜細胞數(shù)量增加，給予0.25，0.75，2μg/mLCelastrol干預后，可劑量依賴性降低內皮細胞遷徙；乏氧可以誘導內皮細胞小管形成，乏氧

4、干預16h后，細胞連接形成小管樣網(wǎng)狀結構，給予0.25，0.75，2μg/mLCelastrol干預后，可劑量依賴性抑制內皮細胞形成管腔的能力；乏氧可以誘導腫瘤細胞骨架重建，乏氧干預16h后，F(xiàn)-actin顯著增加，中間張力絲平行排列，細長的絲狀偽足和片狀偽足明顯可見，給予2μg/mL Celastrol干預后，F(xiàn)-actin細胞形態(tài)明顯回復，僅見少量的絲狀和片層偽足；乏氧可以誘導腫瘤細胞侵襲，乏氧干預16h后，穿越Matrigel“屏

5、障”的細胞數(shù)量增加，給予0.25，0.75，2μg/mL Celastrol干預后，可劑量依賴性抑制腫瘤細胞侵襲；與單純乏氧組相比，Celastrol處理組明顯抑制A549細胞中Sema4D mRNA及膜型和分泌型蛋白的表達。
　　 結論：Celastrol能明顯抑制乏氧誘導的血管新生，下調Sema4D基因及蛋白的表達可能是Celastrol抗乏氧誘導的血管新生的重要機理之一。
　　 第二部分：
　　 目的：研究

6、雷公藤紅素(Celastrol)對乏氧誘導的HIF-1α信號通路及其上游信號通路PI3K/Akt的影響。
　　 方法：在乏氧條件下培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2細胞16h，并以不同濃度Celastrol處理，采用免疫熒光及Western blot檢測Celastrol對乏氧誘導的細胞核內HIF-1α表達的影響；Real-time PCR檢測Celastrol對常氧及乏氧條件下HIF-1αmRNA表達的影響；Real-time PCR檢

7、測Celastrol對HIF-1α靶基因VEGF及CA9 mRNA表達的影響；ELISA檢測Celastrol對VEGF蛋白表達的影響；Western blot檢測Celastrol對Akt及pAkt蛋白表達的影響。
　　 結果：常氧狀態(tài)下HepG2細胞中HIF-1α少量表達且主要表達于胞質，單純乏氧組經(jīng)16h 乏氧干預后HIF-1α表達明顯上調且集中表達于胞核，給予2μg/mL Celastrol 干預后，HepG2細胞中HI

8、F-1α熒光染色強度明顯減弱且胞核中表達下降。Western blot 結果顯示，常氧下，HepG2細胞中僅有微量核蛋白表達。乏氧16 h，HepG2細胞中HIF-1α核蛋白表達顯著增加。給予2μg/mL或4μg/mLCelastrol 干預，HepG2細胞中HIF-1α核蛋白表達顯著降低。Real-time PCR結果顯示，常氧下，0.75-4μg/mL濃度范圍內的Celastrol 對HIF-1αmRNA的表達有明顯的抑制作用。乏氧

9、下，0.25-4μg/mL 濃度范圍內的Celastrol 對HIF-1αmRNA的表達有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。單純乏氧組與常氧相比，VEGF和CA9mRNA表達量顯著增加，0.25-4μg/mL 濃度范圍內的Celastrol 可明顯抑制乏氧誘導的VEGF和CA9 mRNA，且該作用呈劑量依賴性。ELISA 結果顯示，乏氧干預16 h后，VEGF的濃度顯著增加，給予濃度梯度為 0.25，0.75,2μg/mL Celastr

10、ol 處理后，VEGF 濃度明顯下降，且呈劑量依賴性。Western blot 結果顯示，乏氧下，HepG2細胞中Akt和pAkt 蛋白均有較強表達，給予0.25-4μg/mL Celastrol 干預，HepG2細胞中Akt和pAkt蛋白表達均顯著降低。
　　 結論：Celastrol能明顯抑制乏氧腫瘤細胞中HIF-1α信號通路，該作用部分是通過對PI3K/Akt通路的抑制實現(xiàn)的。下調HIF-1α基因及蛋白的表達可能是Cela