眼鏡蛇毒磷脂酶A-,2-抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡不依賴其酶活性.pdf

1、中樞神經(jīng)變性疾病指中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)生退行性變.退行性變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān),在老年性癡呆和帕金森氏病等疾病中起關(guān)鍵作用,因此凋亡的機制是解開這些老年病之謎的鑰匙,也是研制治療藥物的根據(jù).探討中樞神經(jīng)元凋亡機制需要一個可靠、有效、重復(fù)性高、易于操作的細胞模型.小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)在哺乳動物腦中含量豐富.體外培養(yǎng)時,高鉀(25mM KCl)培養(yǎng)基可維持其分化、成熟和存活,而去血清、低鉀(5mM KCl)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化成

2、熟的CGNs凋亡.CGNs來源豐富,體外培養(yǎng)純度可達95％,已使用多年,技術(shù)成熟,結(jié)果可靠,所以此凋亡模型已成為研究神經(jīng)元的一個最常見的模型,被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機制的研究,以及防治與凋亡有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥開發(fā)中.該實驗室首次從眼鏡蛇毒中發(fā)現(xiàn),其中一個酸性蛋白成分200 ng/ml與CGNs孵育16h,可抑制低鉀引起的CGNs凋亡.此組分經(jīng)連續(xù)柱層析分離提純,用SDS-PAGE測出分子量為14 kDa,測N末端20位氨基酸序

3、列發(fā)現(xiàn)與眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>相同,鑒定為眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>,pHstat滴定法測定其磷脂酶A<,2>活性為15.0±0.5 Unit/mg.用蛋白免疫印跡法(western Blotting)研究其保護CGNs的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制發(fā)現(xiàn),其不通過ERKl/2、PI3K/Akt/FKHR、cAMP/PKA通路、鈣通道和α非敏感性N受體這幾條經(jīng)典的神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導(dǎo)通路起作用.磷脂酶A<,2>可通過兩條途徑發(fā)揮生物學(xué)活性:水解重要

4、的磷脂,生成游離脂肪酸和溶血磷脂引起相應(yīng)的藥理效應(yīng),或通過與受體和結(jié)合位點結(jié)合介導(dǎo)其他功能.那究竟眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>抑制低鉀引起的CGNs凋亡是通過其磷脂酶A<,2>活性的水解產(chǎn)物,還是通過與受體和結(jié)合位點結(jié)合起作用?為回答此問題,于是改良眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>分離純化方法,分析其保護作用的量效曲線;研究眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>在各腦區(qū)是否有特異性結(jié)合部位,對大腦皮層神經(jīng)元是否有保護作用;探討其他來源的磷脂酶A<,2>是否也有類

5、似功能,分析它們保護作用的量效曲線;并進一步研究這種保護作用和磷脂酶A<,2>酶活性的關(guān)系.結(jié)論:1.中華眼鏡蛇粗毒5g經(jīng)CM-Sephadex C-50、DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-75連續(xù)柱層析分離,得到50 mg能抑制低鉀引起的CGNs凋亡的純化磷脂酶A<,2>組分.2.眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>在1~400 ng/ml內(nèi)濃度依賴地抑制低鉀引起的CGNs凋亡.3.<'125>I標記眼鏡蛇毒磷脂酶A<,

6、2>在大鼠腦內(nèi)的結(jié)合部位密度從高到低分別是:基底核、腦干、大腦皮層、中腦、白質(zhì)、小腦.4.100~800 ng/ml的眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>不能抑制秋水仙堿誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡.5.眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>保護CGNs作用和磷脂酶A2活性分離.因為化學(xué)修飾使眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性幾乎消失,而保護CGNs的能力保留;熱處理后的眼鏡蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性保留,而保護CGNs的能力大幅度降低;多個蛇毒和蜂毒來源的磷脂酶A<,