p115在氧化應(yīng)激中介導(dǎo)高爾基體應(yīng)激機制研究.pdf

1、目的:利用體外細胞氧化應(yīng)激模型探索在缺血性腦損傷中，高爾基體囊泡轉(zhuǎn)運蛋白p115表達及裂解變化，及其與凋亡信號因子激活的關(guān)系，探討p115介導(dǎo)高爾基體應(yīng)激的機制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)小鼠神經(jīng)瘤N2a細胞，通過不同濃度H2O2干預(yù)建立氧化應(yīng)激模型，采用MTT法、流式細胞術(shù)等評價氧化應(yīng)激模型。
　　2.實驗分為氧化應(yīng)激組、保護性藥物干預(yù)后氧化應(yīng)激組和正常對照組;其中氧化應(yīng)激H2O2干預(yù)濃度分為40umol/l、80u

2、mol/l兩個濃度梯度;保護性藥物為抗氧化劑丙酮酸鈉，可以抑制caspase-3的激活，減少p115裂解。
　　3.Western blot法檢測各組中p115、p115 C末端片段、p53、p-p53(ser15)的蛋白表達變化;
　　4.流式細胞術(shù)測定各組凋亡率的變化（Annexin V-FITC/PI）;
　　5.MTT法測定并計算各組存活率的變化;
　　6.免疫熒光共聚焦方法觀察p115的亞細胞定位及在應(yīng)

3、激中碎裂情況。
　　實驗結(jié)果:
　　1.H2O2干預(yù)氧化應(yīng)激后細胞形態(tài)的變化、細胞存活率及凋亡率檢測顯示:隨著H2O2濃度的增加，干預(yù)組小鼠N2a細胞的MTT值與正常對照組相比，MTT值顯著減少（P＜0.05），凋亡率明顯增加（P＜0.05），表明不同濃度H2O2造成的氧化應(yīng)激引起了細胞損傷，導(dǎo)致了細胞凋亡的發(fā)生，H2O2的濃度可以造成不同程度的氧化應(yīng)激損傷。
　　2.藥物干預(yù)后再予以H2O2處理，24小時后觀察細胞變

4、化細胞存活率及凋亡率檢測顯示:N2a細胞形態(tài)變化較非藥物干預(yù)組變化不明顯，MTT值高于非藥物干預(yù)組(P＜0.05)，凋亡率小于非藥物干預(yù)組(P＜0.05)，表明抗氧化預(yù)處理可以減輕H2O2誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。
　　3.p115、p53表達的變化:H2O280umol/l干預(yù)后的2小時、4小時、8小時、12小時和24小時，隨著時間的延長，p115(115KD)全長表達逐漸減低，p115-CTF表達持續(xù)上升，p53表達較對照組無明顯變

5、化，而p-p53(ser15)表達上升并在4小時達到峰值，此后下降。說明在H2O2的干預(yù)下，p115發(fā)生了持續(xù)性的裂解，p53發(fā)生了磷酸化;在H2O240umol/l，80umol/l及藥物處理4小時后，高濃度H2O2干預(yù)下，p115 C末端片段、p-p53(ser15)的表達變化一致，均較低濃度組增加（P＜0.05），p115的表達較低濃度組減少（P＜0.05），而p53表達無顯著差異（P＞0.05），在藥物干預(yù)組p115、p115

6、C末端片段、p53及p-p53(ser15)的表達均無顯著差異。結(jié)果提示p115 C末端片段的生成與p53在ser15位點上的磷酸化有關(guān)，藥物干預(yù)減少了p115的裂解，繼而減少了p53的磷酸化。
　　4.p115細胞內(nèi)定位及形態(tài)變化:免疫共聚焦顯微鏡下觀察到隨著H2O2濃度的增加，p115的紅色熒光由正常狀態(tài)下的環(huán)繞于核周的緊湊囊泡樣結(jié)構(gòu)逐漸向胞漿散開，部分呈點狀散布于整個細胞質(zhì)中。結(jié)果提示在氧化應(yīng)激模型中，隨著應(yīng)激程度的加重，p