2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、[背景與目的]
   ABCG2轉(zhuǎn)運子(ATP-Binding Cassette Family G2 Transporters)亦稱乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP),是由ABC基因家族編碼的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白。ABCG2基因定位于人類染色體4q22,編碼655個氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白。該類蛋白均有ATP結(jié)合位點,通過水解ATP提供能量將底物逆勢轉(zhuǎn)運至細胞膜外或細胞器中,其

2、轉(zhuǎn)運底物包括各種藥物/毒素及其代謝物、生理代謝物、營養(yǎng)物、脂類和多肽等。眾多研究顯示,ABCG2在大多數(shù)正常組織中高表達,包括腦、腸道、肝、胎盤、生殖腺和骨髓等組織,從而保護這些組織免于藥物及毒物的影響,對維持人體正常生理功能和減輕病理損傷起著至關(guān)重要作用。本課題組多年來一直從事ABCG2的研究,并首次發(fā)現(xiàn)ABCG2具有保護細胞免受活性氧(reactive oxygen species,ROS)誘導的細胞損害的作用。本研究在此基礎(chǔ)上,進

3、一步研究了ABCG2在ROS誘導的細胞損傷中的作用及其可能涉及的信號通路,為深入探討ABCG2在H2O2誘導的氧化應(yīng)激中的保護作用及其可能機制提供了重要的實驗依據(jù)。同時初步探究了ABCG2在阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)發(fā)病過程中的保護作用,以期進一步明確AD的發(fā)病機制及為AD的預防提供實驗依據(jù)。
   [方法]
   1.ABCG2-pTT5SH8Q2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增、鑒定及重組質(zhì)粒在

4、細胞內(nèi)(人胚腎上皮細胞HEK293及小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞株N2a-695)的表達和表達效率的鑒定(Western blot,免疫熒光)。(pTT5SH8Q2空載質(zhì)粒,以下簡稱PTT)
   2.ROS assay及抗氧化能力測定實驗分別檢測ABCG2在過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)和/或叔丁基過氧化氫(tert-Butyl hydroperoxide,TBHP)誘導的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及細胞抗氧化能力變

5、化過程中的作用。
   3.PI assay(Propidium Iodid,碘化丙啶)檢測ABCG2在H2O2誘導的細胞毒性中的作用。
   4.RT-PCR及RT-qPCR檢測ABCG2對H2O2誘導的炎癥因子(IL-8,GRO或GRO-β)mRNA表達中的影響。ELISA進一步檢測ABCG2在H2O2誘導的IL-8蛋白分泌中的影響。
   5.Western blot檢測ABCG2在H2O2誘導的細胞內(nèi)NF

6、-κB信號通路中的作用,體內(nèi)實驗中Western blot檢測NF-κB信號通路在Abcg2基因敲除及野生型小鼠中的表達情況。
   6.血紅素轉(zhuǎn)運實驗及ROS assay分別檢測ABCG2對氯化血紅素(hemin chloride)在細胞轉(zhuǎn)運中的作用及其對氯化血紅素誘導的ROS產(chǎn)生中的作用。
   7.Western blot檢測ABCG2在AD、AD合并腦淀粉樣變性血管病(cerebral amyloid angio

7、pathy,CAA)及年齡相仿的無癡呆(No dementia,ND)腦組織中的表達情況。
   8.活體掃描檢測ABCG2對β-淀粉樣蛋白1-40(amyloid peptide1-40,Aβ1-40)進出Abcg2基因敲除小鼠及野生型小鼠血腦屏障的影響。免疫熒光進一步檢測不同小鼠腦內(nèi)Aβ1-40的沉積情況。
   9.Western blot及RT-PCR分別檢測氧化應(yīng)激條件下,ABCG2對高表達β-淀粉樣前體蛋白(

8、amyloid precursor protein,APP)的N2a-695細胞中APP表達的影響。Aβ1-40ELISA進一步檢測相同條件下,ABCG2對N2a-695細胞內(nèi)Aβ1-40產(chǎn)生的影響。
   10.分泌酶測定實驗檢測氧化應(yīng)激條件下,ABCG2對N2a-695細胞中α-,β-,γ-分泌酶活性的影響。
   [結(jié)果]
   1.成功構(gòu)建ABCG2-PTT重組質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測序均證實質(zhì)粒

9、構(gòu)建成功,序列正確。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染ABCG2-PTT重組質(zhì)粒入HEK293及N2a-695細胞,Western blot提示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細胞48h后,ABCG2蛋白表達達到峰值。故本研究中,均在確保重組質(zhì)粒在細胞中表達48h后行后續(xù)實驗。原位免疫熒光顯示該重組質(zhì)粒在兩種細胞中的表達效率均為60%以上。
   2.ROS assay實驗結(jié)果顯示,與未加H2O2的對照組(H2O)相比,H2O2(

10、0.5,1,2μM;2h)及TBHP(100μM;2h)均能明顯誘導HEK293細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.05),而ABCG2能抑制這一過程中細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.05);抗氧化能力測定實驗結(jié)果顯示ABCG2可增加H2O2(2μM;6h)誘導的氧化應(yīng)激反應(yīng)下細胞的抗氧化能力(P<0.05)。
   3.PI assay實驗結(jié)果顯示,與對照組(H2O)相比,H2O2(0.5,1,2μM;2,6,16h)能誘導明顯的細胞毒作

11、用(P<0.001),而ABCG2能抵抗H2O2(2μM;16h)誘導的細胞毒作用(P<0.001)。
   4.RT-PCR實驗結(jié)果顯示,與對照組(H2O)相比,H2O2(0.5,1,2μM;2,4,6h)明顯誘導HEK293細胞中炎癥因子(IL-8,GRO)mRNA表達(P<0.05)。RT-qPCR實驗結(jié)果亦證實,和對照組(H2O)相比,H2O2(0.5,1,2μM;6h)能明顯誘導HEK293細胞中IL-8和GRO-β基

12、因的表達(P<0.05),而ABCG2能減少這一過程中IL-8、GRO-β的表達(P<0.01)。ELISA實驗結(jié)果在蛋白水平進一步證實,和對照組(H2O)相比,H2O2(1μM;6h)能明顯誘導HEK293細胞中炎癥因子IL-8的分泌(P<0.001)。與PTT空載處理組相比,ABCG2能夠明顯減少H2O2誘導的IL-8的分泌(P<0.05)。
   5.Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組(H2O)相比,H2O2(

13、0.5,1,2μM;2h)明顯誘導HEK293細胞中NF-κB信號通路的活化(P<0.05),而ABCG2能抑制細胞內(nèi)H2O2誘導的NF-κB信號通路的活化(P<0.01)。體內(nèi)實驗中,與野生型小鼠相比,Abcg2基因敲除小鼠的腦勻漿組織中,NF-κB信號通路活化顯著增多(P<0.01)。
   6.血紅素轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果顯示ABCG2能夠減少血紅素轉(zhuǎn)運入細胞胞漿內(nèi)(P<0.05)。ROS assay顯示血紅素能夠誘導細胞產(chǎn)生ROS

14、(P<0.01),而ABCG2通過減少血紅素進入細胞而降低其誘導的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.001)。
   7.Western blot實驗結(jié)果顯示,與正常年齡相仿的ND正常人腦組織相比,AD以及AD/CAA患者腦組織中ABCG2的蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。
   8.活體掃描實驗結(jié)果及后續(xù)小鼠腦組織的免疫熒光結(jié)果均顯示,與野生型小鼠相比,Abcg2基因敲除小鼠腦內(nèi)Aβ1-40沉積明顯增加。提示ABCG2

15、能夠阻止Aβ1-40通過血腦屏障進入小鼠腦內(nèi)(P<0.05)。
   9,Western blot實驗結(jié)果顯示,H2O2(2μM;4,6h)能夠誘導N2a-695細胞中APP的酶解(P<0.05),而ABCG2可減少這一過程中N2a-695細胞內(nèi)APP的酶解(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,ABCG2對APP的基因表達無影響,因為APP基因已穩(wěn)轉(zhuǎn)入細胞,故能持續(xù)高表達。Aβ1-40ELISA實驗結(jié)果進一步顯示,ABCG2能

16、夠降低H2O2(1μM;4,6h)應(yīng)激所致N2a-695細胞中Aβ1-40的產(chǎn)生(P<0.01)。
   10.分泌酶測定實驗結(jié)果顯示,與對照組(H2O)相比,H2O2(0.5,1,2μM;6h)能明顯增加N2a-695細胞中a-,β-,γ-分泌酶的活性(P<0.05),而ABCG2能夠明顯減少氧化應(yīng)激條件下N2a-695細胞內(nèi)α-,β-,γ-分泌酶的活性(P<0.05)。
   [結(jié)論]
   1.ABCG2通

17、過抑制氧化應(yīng)激條件下細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,增加細胞抗氧化能力,從而有助細胞抵抗ROS誘導的細胞毒作用;同時亦能抑制氧化應(yīng)激條件下細胞內(nèi)炎癥因子(IL-8,GRO)的表達及分泌(1L-8),從而發(fā)揮其抗炎癥效應(yīng)。ABCG2能發(fā)揮上述保護作用的可能機理是ABCG2能減少作為其轉(zhuǎn)運底物之一的血紅素(作為前氧化應(yīng)激因子)進入細胞,從而減少血紅素誘導的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
   2.體外實驗證實ABCG2在氧化應(yīng)激中的保護作用可能是由NF-

18、κB信號通路介導的,體內(nèi)實驗亦證實,ABCG2能抑制NF-κB信號通路的激活。
   3.ABCG2在AD及CAA/AD患者腦內(nèi)高表達,推測ABCG2可能在AD病理生理過程中發(fā)揮保護作用,其中涉及的可能機制有:ABCG2作為血腦屏障上的藥物轉(zhuǎn)運子,可阻止Aβ1-40進入血腦屏障,從而直接減少Aβ140在小鼠腦內(nèi)沉積:ABCG2通過減少氧化應(yīng)激條件下細胞內(nèi)Aβ前體蛋白APP的酶解,降低參與APP酶解的分泌酶的活性,最終導致細胞分泌

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