高爾基體蛋白73(GP73)表達(dá)對高爾基體結(jié)構(gòu)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.pdf

1、目的:
　　 GP73作為新發(fā)現(xiàn)的在肝癌組織和血清中表達(dá)異常增加的高爾基體定位蛋白，其功能尚不明確，僅知道它與某些腫瘤如肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，我們推測其可能對細(xì)胞高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的維持具有重要作用，但仍需要進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)從改變GP73表達(dá)對細(xì)胞高爾基體形態(tài)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響的角度去研究GP73在細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　 方法:
　　 1通過基因工程方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建pGEX-5X-1-StxB重組質(zhì)粒

2、，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)GST-StxB-His融合蛋白，采用GST親和層析純化蛋白，并使用腸激酶酶切GST-StxB-His融合蛋白獲得StxB-His蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);
　　 2本文通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染GP73的特異性siRNA片段來降低細(xì)胞中GP73的表達(dá)，并通過Western blotting和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定干擾效果;
　　 3采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察降低GP73表達(dá)的細(xì)胞中與高爾基體組裝和

3、結(jié)構(gòu)維持相關(guān)的高爾基體蛋白GM130和Golgin84的胞內(nèi)定位。
　　 4RNA干擾降低GP73表達(dá)，采用熒光淬滅后恢復(fù)（FRAP）技術(shù)觀察高爾基體的連續(xù)性和流動性;
　　 5在降低GP73表達(dá)的Hela細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染VSVG-GFP質(zhì)粒，采用激光掃描共焦顯微鏡觀察VSVG-GFP蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn);
　　 6用StxB-His蛋白孵育細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光的方法觀察在降低GP73表達(dá)的Hela細(xì)胞中StxB-Hi

4、s的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié)果:
　　 1本文通過基因工程方法成功獲取了有活性的StxB蛋白;并通過RNA干擾的方法成功降低了HepG2及Hela細(xì)胞中GP73的表達(dá)。
　　 2降低HepG2和Hela細(xì)胞中GP73的表達(dá)，可引起GM130和Golgin84失去高爾基體緊湊結(jié)構(gòu)，呈離散分布，而對反面高爾基膜囊標(biāo)志蛋白TGN46沒有影響;FRAP實(shí)驗(yàn)中，降低Hela細(xì)胞中GP73的表達(dá)后，高爾基體上指定區(qū)域內(nèi)熒光淬滅后