高爾基體中糖基轉(zhuǎn)移酶的信號(hào)介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)保留

1、高爾基體中糖基轉(zhuǎn)移酶的信號(hào)介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)保留LinnaLinnaTuTuWilliamWilliamC.C.S.S.TaiTaiLuLuChenChenDavidDavidK.K.BanfieldBanfield?高爾基的糖基轉(zhuǎn)移酶是一種酶家族的有序的修改糖蛋白的具體方式蛋白。第二類組成，這些膜蛋白的特點(diǎn)是短期暴露細(xì)胞質(zhì)氨基末端尾巴和一腔酶域。細(xì)胞質(zhì)尾巴發(fā)揮本地化的糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，外殼蛋白復(fù)合物COPI泡介導(dǎo)的逆行運(yùn)輸也在高爾基內(nèi)工作。然

2、而，這些酶缺乏的尾巴能識(shí)別COPI序列。在這里，我們發(fā)現(xiàn)Vps74p綁定到在多數(shù)的酵母細(xì)胞質(zhì)尾巴五聚體主題目前高爾基本地化的糖基轉(zhuǎn)移酶，以及COPI。我們建議Vps74p保持穩(wěn)定，高爾基州的糖基轉(zhuǎn)移酶動(dòng)態(tài)定位到COPI通過促進(jìn)其納入小泡。在高爾基體的功能，作為新合成的蛋白質(zhì)分揀中心和作為糖蛋白的翻譯后修飾的位置。蛋白糖基化是發(fā)起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）。糖蛋白，然后經(jīng)過由高爾基組本地化廣泛的順序糖基轉(zhuǎn)移酶糖鏈伸長(zhǎng)和闡述介導(dǎo)的。雖然他們獨(dú)特的催化

3、糖基化反應(yīng)，并顯示腦池的分布特點(diǎn)，高爾基居民糖基轉(zhuǎn)移酶都是II型膜蛋白組成的短期暴露細(xì)胞質(zhì)N末端（尾）組成一個(gè)單獨(dú)得薄膜區(qū)，一個(gè)導(dǎo)向主干區(qū)域和催化結(jié)構(gòu)域的腔。Avariety的功能已確定了影響這些酶（13）：在跨膜區(qū)（48），特定區(qū)的腔面向非催化區(qū)（68），催化域之間的相互作用（9，10）和細(xì)胞質(zhì)尾（1113）。穩(wěn)態(tài)這些酶的分布狀態(tài)維持一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，它涉及到從晚期高爾基到早期生理池的檢索，以及與高爾基和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，于是他們過境回到池對(duì)它們

4、的功能（14，15）。雖然糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，直接的一個(gè)特定的酶一池或另一穩(wěn)態(tài)變化，大概外殼蛋白復(fù)合物（COPI），小泡是由其中這些酶大部分被回收（14，16的主要手段）。然而，高爾基居民糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏規(guī)范COPI在其細(xì)胞質(zhì)尾巴結(jié)合基序，我們?cè)O(shè)法查明的蛋白質(zhì)，可以結(jié)合這些酶的尾巴，COPI可以促進(jìn)其納入小泡。我們確定了一個(gè)基本與高爾基刪除相關(guān)的殺傷力居民圈套遺傳屏幕前部抑制Vps74p（水溶性N乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體），Sft

5、1p，高爾基內(nèi)的（17）逆行運(yùn)輸所需的一種蛋白質(zhì)。Vps74p是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，其中包括哺乳動(dòng)物蛋白GPP34（GmX33a）和GPP34R（GmX33b）（1821）的成員。雖然VPS74刪除了對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響，vps74D細(xì)胞已知非分類的羧肽酶Y，這說明Vps74p參與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸（22）。我們注意到，vps74D缺陷細(xì)胞中的糖基（GPI）的處理錨定蛋白Gas1p。Gas1p是修改增加了N和O連接碳水化合物，因?yàn)樗┰酵局械?/p>

6、高爾基體與細(xì)胞表面（圖1A）（23）。在酵母中的Gas1p缺乏N中所涉及的酶菌株命運(yùn)的比較和Oglycosylation揭示了在缺乏的A12mannosyltransferase，Kre2p（圖1，A和B）（24）細(xì)胞類似的加工缺陷。我們考慮到Vps74p可能需要Gas1p運(yùn)輸和審查功能Gas1p販運(yùn)單體的可能性，紅色熒光蛋白（Gas1pmRFP）融合蛋白在細(xì)胞缺乏Vps74p（25）。然而，Gas1p位置在vps74D細(xì)胞mRFP是無

7、法區(qū)別的，在野生型細(xì)胞（圖1c）。像GPP34（18），Vps74p是一個(gè)外周膜蛋白（圖1，D和E），因此，只會(huì)有能力直接的物理與細(xì)胞質(zhì)相互作用面向N端11個(gè)氨基酸的Kre2p。我們建造了一個(gè)混合體，其中蛋白質(zhì)的Kre2p的細(xì)胞質(zhì)和跨膜區(qū)域融合到N端該Anp1Kre2混合蛋白恢復(fù)Gas1p加工kre2D細(xì)胞（圖3a）的無力令人費(fèi)解，因此我們認(rèn)為有可能承認(rèn)的Vps74pglycosyltransferas中，除了滑膜樣主題。最近的一項(xiàng)研究

8、表明，一個(gè)在Mnn9p回收二元序列從高爾基重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（13），和我們的酵母雙雜交化驗(yàn)，Kre2p穩(wěn)定性研究和活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的支持，為KR8肽要求在Vps74的Kre2p（圖四）依賴保留。此外，我們發(fā)現(xiàn)沒有滑膜樣內(nèi)殘留的要求極樣Kre2p主題，而F4和L5，是必不可少的結(jié)合Vps74p（圖五）。因此，Vps74p關(guān)于酵母高爾基體結(jié)合位點(diǎn)，符合居民的糖基轉(zhuǎn)移酶的(FL)(LIV)XX(RK)的一個(gè)主題是在16高爾基居民酶的存在（見表1

9、）。為了測(cè)試這項(xiàng)建議的有效性，我們研究了Mnn5命運(yùn)綠色熒光蛋白，其中包含一個(gè)序列，符合共識(shí)（LIXXK6）在vps74D細(xì)胞。與我們的預(yù)測(cè)，Mnn5綠色熒光蛋白相一致的是非局部化在這些細(xì)胞中（圖六）液泡流明。Vps74p可以促進(jìn)或阻止從高爾基這些酶順販運(yùn)或協(xié)助其通過高爾基回收池或從高爾基體到急診室，在這個(gè)過程通過COPI大衣（圖中一）糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)高爾基保留。為了區(qū)分這些可能性，我們研究了Kre2CT命運(yùn)綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的組成性高

10、表達(dá)Vps74p。我們推斷，如果Vps74p運(yùn)作在急診室回收途徑，表達(dá)的蛋白質(zhì)可能將轉(zhuǎn)向穩(wěn)定的Kre2CT態(tài)分布，從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)綠色熒光蛋白。這確實(shí)是如此VPS74表達(dá)了對(duì)穩(wěn)定的Kre2CT國家定位的影響，綠色熒光蛋白是不是因?yàn)樵诩痹\室塊或間接出口到逆行運(yùn)輸一般加速度（圖三維）。Vps74p綠色熒光蛋白在Kre2CT的逆行運(yùn)輸作用也得到了我們的基因研究。除了VPS74，我們還發(fā)現(xiàn)基因編碼的高爾基囊泡大衣復(fù)雜COPI或基板（圖七）組件

11、。由于Sft1p是在高爾基（17）逆行運(yùn)輸需要，我們推測(cè)，作此sft1D細(xì)胞缺乏這些基因表達(dá)的補(bǔ)償。此外，觀察基因之間的相互作用和VPS74缺陷突變體在ER高爾基販賣（圖七）。鑒于Mnn9p復(fù)雜（16）和Kre2CT綠色熒光蛋白（圖中一）周期的電腦操作員之間的高爾基體和ER依賴性，我們認(rèn)為有可能Vps74p可能功能的電腦操作員共同調(diào)解回收?qǐng)D2。VPS74的刪除導(dǎo)致非局部化和高爾基一個(gè)子集糖基轉(zhuǎn)移酶的降解。（甲）Mnn2綠色熒光蛋白，Mn

12、n9綠色熒光蛋白，并Ktr6CT綠色熒光蛋白是vps74D細(xì)胞的非局部化。（乙）氨基酸的替換在Kre2胞質(zhì)尾FLS6序列[kre2（AAA6）的CT綠色熒光蛋白]結(jié)果的蛋白質(zhì)非局部化。（A和B）比例尺，5毫米。（丙）細(xì)胞表達(dá)作為其Kre2p的唯一來源kre2（AAA6）有缺陷的Gas1p處理。（?。﹌re2（AAA6）是不穩(wěn)定的vps74D細(xì)胞。（）或（）表示h后內(nèi)切糖苷。在糖化（糖）和deglycosylated（去糖）的Kre2p形

13、式，見箭頭。有關(guān)的試劑和方法的詳細(xì)說明使用，見（24）。WT野生型。表1在酵母細(xì)胞質(zhì)尾巴氨基酸序列高爾基居民糖基轉(zhuǎn)移酶（27）。滑膜樣在突出的斜體字中。糖基轉(zhuǎn)移酶軸承推定Vps74p結(jié)合，(FL)(LIV)XX(RK)主題突出顯示粗體和他們的相應(yīng)的主題是強(qiáng)調(diào)和斜體字中。酶氨基酸序列的胞質(zhì)尾Kre2MALFLSKRLLRKtr1MAKIMIPASKQPVYKKKtr2MQICKVFLTQVKKKtr3MSVHHKKKLMPKSALLIRK