水稻CCT家族基因功能驗(yàn)證，OsMADS3新等位基因突變機(jī)制的研究.pdf

1、1.植物開(kāi)花是一個(gè)受外界環(huán)境和內(nèi)在基因共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，許多基因家族共同參與，形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CCT基因家族基因參與調(diào)控植物開(kāi)花。目前，水稻中41個(gè)CCT基因成員只有6個(gè)基因被證實(shí)調(diào)控開(kāi)花。為更高效鑒定更多的CCT家族開(kāi)花基因，本研究結(jié)合候選基因關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析鑒定功能基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，并對(duì)其中一個(gè)CCT基因進(jìn)行功能研究。研究結(jié)果如下:
　　1.1候選基因關(guān)聯(lián)分析與功能驗(yàn)證
　　通過(guò)整合公共數(shù)據(jù)庫(kù)的水稻開(kāi)花期Q

2、TL信息，共得到59個(gè)水稻開(kāi)花期QTLs，與水稻41個(gè)CCT基因的物理位置比較，發(fā)現(xiàn)有25個(gè)CCT基因位于QTL區(qū)間內(nèi)。利用529份世界水稻種質(zhì)資源對(duì)CCT家族基因與水稻抽穗期性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共有19個(gè)CCT基因與抽穗期相關(guān)。我們選擇了18個(gè)CCT基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，結(jié)果表明，8個(gè)關(guān)聯(lián)基因落在QTL區(qū)間，有5個(gè)基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證確定調(diào)控開(kāi)花;4個(gè)關(guān)聯(lián)基因不在QTL區(qū)間，但有2個(gè)通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證與開(kāi)花相關(guān);6個(gè)既沒(méi)關(guān)聯(lián)到也不在QTL區(qū)間的基

3、因都不參與水稻開(kāi)花調(diào)控。
　　1.2 CCT家族基因表達(dá)模式與核酸多樣性
　　根據(jù)基因所含功能結(jié)構(gòu)域?qū)CT基因分為CMF亞家族，COL亞家族和PRR亞家族。在日本晴5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的葉片和莖稈中對(duì)CCT的35個(gè)基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞家族的基因大部分都在葉片中表達(dá)豐富，部分基因在莖稈中也有較高的表達(dá)。41個(gè)CCT基因在529份栽培稻和107份野生稻中中共有4002個(gè)SNPs，CCT家族基因的平均核酸多樣性兀=2.

4、7×10-3，多數(shù)CCT基因的核酸多樣性在每1kb有1到8個(gè)SNPs。
　　1.3 OsCCT01基因功能研究
　　OsCCT01屬于CMF亞家族，超量表達(dá)OsCCT01導(dǎo)致中花11在長(zhǎng)日照下抽穗期延遲25天，短日照下延遲15天。抑制表達(dá)OsCC T01則沒(méi)有出現(xiàn)抽穗期相關(guān)表型。通過(guò)檢測(cè)光周期途徑相關(guān)基因在超表達(dá)植株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsCCT01是通過(guò)抑制Ehd1基因及其下游Hd3a和RFT1基因的表達(dá)而抑制開(kāi)花。除了抽穗期的

5、表型，OsCCT01同時(shí)出現(xiàn)株高變矮，分蘗減少，產(chǎn)量下降等發(fā)育相關(guān)表型，通過(guò)激素處理發(fā)現(xiàn)OsCCT01對(duì)BR響應(yīng)顯著，檢測(cè)BR受體基因OsBRI1和BR信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的相關(guān)基因在超量植株中的表達(dá)水平的變化，推測(cè)OsCCT01參與BR信號(hào)傳導(dǎo)途徑;檢測(cè)了細(xì)胞周期基因在超表達(dá)植株中的表達(dá)量差異，結(jié)果表明3個(gè)G2/M期的基因在OsCCT01超表達(dá)陽(yáng)性植株中明顯下降。推測(cè)，OsCCT01可能處在細(xì)胞周期核心調(diào)控元件的下游調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂。OsCCT

6、01對(duì)植株發(fā)育的機(jī)制有待深入研究。
　　2.作物遺傳改良的基礎(chǔ)是自然變異，自然變異是由自發(fā)突變形成。在構(gòu)建重組自交系過(guò)程中，RI127發(fā)生自然突變成隱性雄性核不育系RI127S。通過(guò)圖位克隆的方法鑒定出OsMADS3就是控制雄性不育的基因，該基因已有文獻(xiàn)報(bào)道其調(diào)控花器官發(fā)育和雄性不育。利用交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR分離到1633 bp序列插到OsMADS3基因內(nèi)部，導(dǎo)致它不能正常轉(zhuǎn)錄而喪失功能。1633 bp序列來(lái)自第5染色體上一個(gè)反轉(zhuǎn)

7、座子的片段。分析OsMADS3在530份自然群體和107份普通野生稻中的核酸多態(tài)性，共有7種單倍型，98％的品種是都是H2類(lèi)型，表明OsMADS3是功能特別重要的持家基因，在自然進(jìn)化過(guò)程中必須高度保守，這與它決定雄性育性是吻合的。RI127S來(lái)自秈稻特青和廣親和品種02428雜交后代，攜帶02428的S5基因型。RI127具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀和廣親和性，因此RI127S是輪回育種中一個(gè)好的中間體，省去輪回選擇中品種間雜交的繁重人工去雄工作