貝西滑刃線蟲轉(zhuǎn)錄組測序及糖苷水解酶16基因克隆.pdf

1、貝西滑刃線蟲作為一種植物寄生線蟲，廣泛寄生于多種植物中。據(jù)記載有35個屬。線蟲通過分泌纖維素酶來降解植物細胞壁，以便進入植物組織，致使植物感病。為研究線蟲侵染相關(guān)基因及其致病過程、為基因平移假說提供佐證，進行了相關(guān)研究。
　　試驗用東北林業(yè)大學森林病理標本室保存的貝西滑刃線蟲種群，分離擴繁備用。Trizol提取線蟲總RNA，純化RNA后經(jīng)過分光光度計檢驗符合要求;轉(zhuǎn)錄組測序文庫制備采用Illumina/Solexa標準操作步驟由L

2、C公司完成，共得到46，826，350個rawreads，通過后續(xù)嚴格篩選得到36，905，372個高質(zhì)量clean reads，平均長度為89.89 bp。clean reads占總raw reads的78.81％;使用軟件Trinity，應(yīng)用paired-end的拼接方法將線蟲有效reads進行de novo拼接，統(tǒng)計產(chǎn)生51，270個長度均大于200bp的transcript，平均長度為1241bp，N50值為1857bp。對35

3、，180個unigenes進一步聚類和評估分析表明他們的平均長度為1，050 bp，N50值為1626bp。在這些unigenes中有21，882個長度大于500bp（占總體62.2％），13，259個長度大于1000bp（占總體37.7％）;通過BLASTX檢索NR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫篩選糖苷水解酶直系同源基因，篩選到4個碳水化合物酶家族的524個酶基因序列:其中包括10個糖苷水解酶家族的136個具糖苷水解酶結(jié)構(gòu)域的基因序列，28個糖基轉(zhuǎn)移酶

4、家族的328個糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，2個碳水化合物酯酶家族的42個碳水化合物酯酶基因，3個碳水化合物結(jié)合模塊家族的18個碳水化合物結(jié)合模塊基因。
　　RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，根據(jù)篩選到的AbGH16序列設(shè)計引物，以第一鏈cDNA為模板進行完整閱讀框區(qū)域序列的PCR擴增，得到序列長779bp;BLASTX/BLASTP篩選NCBI登錄的GH16蛋白同源序列8條。應(yīng)用Mega5.05選用WAG模型構(gòu)建的最大擬自然樹明顯分為兩

5、支。對NCBI收錄的所有GH16蛋白同源序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明:AbGH16蛋白與真菌GH16蛋白親緣關(guān)系近;經(jīng)ORF分析得到蛋白質(zhì)序列，含有259個氨基酸，相對分子質(zhì)量29.066，等電點為8.11。通過SignalP4.1 Server對貝西滑刃線蟲AbGH16蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明在該蛋白質(zhì)的N端1～20個氨基酸區(qū)段具有跨膜結(jié)構(gòu)域;Hphob./Kyte&Doolittle分析表明，該區(qū)段氨基酸序列疏水性強，說明該蛋白質(zhì)

6、是分泌蛋白;蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析表明， AbGH16蛋白屬于葡聚糖內(nèi)切酶。進一步結(jié)構(gòu)分析表明，源自貝西滑刃線蟲的AbGH16蛋白以及松材線蟲GH16蛋白結(jié)構(gòu)相似。AbGH16蛋白與源自草酸青霉的GH16三維結(jié)構(gòu)相對松材線蟲而言更為相似，這兩個蛋白質(zhì)在兩個連續(xù)的反向平行的β折疊中間均出現(xiàn)小α螺旋結(jié)構(gòu)。而與源自細菌的GH16三維結(jié)構(gòu)，具有4個β折疊的差異，推想貝西滑刃線蟲AbGH16基因從真菌基因平移而來。
　　本研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)來

7、確定糖苷水解酶基因16在線蟲體內(nèi)的表達部位。地高辛(Digoxin)標記的來源自AbGH16基因的正義探針原位雜交，沒有檢測到信號。地高辛標記的來源自AbGH16基因的反義探針原位雜交，在貝西滑刃線蟲食道腺區(qū)域顯示出明顯信號;這一結(jié)果表明，該基因確實是貝西滑刃線蟲基因，該基因在食道腺表達。
　　通過熒光定量PCR來檢測不同株系貝西滑刃線蟲糖苷水解酶16基因的表達量。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，GH16的相對表達量與其致病性正相關(guān)，致病性強的蟲株G