罹病莖瘤芥腈水解酶基因克隆及動(dòng)態(tài)表達(dá)RT-qPCR分析.pdf

1、莖瘤芥（榨菜）是我國(guó)的特色作物，涪陵榨菜是涪陵區(qū)產(chǎn)業(yè)中的優(yōu)勢(shì)、支柱產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中具有重要地位，但是近年來(lái)，重慶涪陵及國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的榨菜產(chǎn)量受到根腫病的嚴(yán)重影響，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。十字花科根腫病是一種土傳病害，主要侵染十字花科作物，而且土壤一旦受到根腫菌的感染，帶菌時(shí)間較長(zhǎng)，不再適宜十字花科作物的種植?；瘜W(xué)防治在一定程度上可以防治根腫病，但不能徹底根治，所以為了徹底控制根腫病的發(fā)生，當(dāng)務(wù)之急是了解根腫病的致病機(jī)理。根腫病的典型特征是

2、根部腫瘤的形成，主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的過(guò)度合成，腈水解酶是合成生長(zhǎng)素途徑中的關(guān)鍵酶，將吲哚-3-乙腈（IAN）轉(zhuǎn)化為吲哚乙酸（IAA），近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。本研究采用人工接種根腫菌接種體的方法，以莖瘤芥健根和病根為實(shí)驗(yàn)材料，采用Real-timePCR技術(shù)，用穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為內(nèi)參基因，分析腈水解酶基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探索腈水解酶與根腫病發(fā)病的關(guān)系，以期為研究根腫病的致病機(jī)理提供依據(jù)。
　　為了獲得各期根腫病發(fā)病材料，采

3、用珍珠巖加MS培養(yǎng)液建立了無(wú)土快繁人工種植體系，為大量培養(yǎng)莖瘤芥幼苗用于致病性測(cè)試提供了均一化接種材料。當(dāng)莖瘤芥生長(zhǎng)至四片真葉時(shí)，處理組每缽人工接種500毫升（108個(gè)孢子/mL）根腫菌接種體，對(duì)照組加入等量的滅菌水，分別在處理后10，15，20，25，30和40天時(shí)，收獲莖瘤芥的根，為本研究的實(shí)驗(yàn)材料。
　　設(shè)計(jì)篩選內(nèi)參基因和腈水解酶基因引物，優(yōu)化退火溫度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)獲得擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)值進(jìn)一步驗(yàn)證引物。定期收獲莖瘤

4、芥的根，提取總RNA，進(jìn)行DNase酶處理，RNA純化，合成cDNA一鏈，以此為模板用篩選得到的引物對(duì)，采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)參基因和腈水解酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)geNorm和NormFinder軟件分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，用于腈水解酶基因的表達(dá)量矯正。
　　geNorm軟件分析結(jié)果表明：ACT和UBE在處理組和對(duì)照組共12個(gè)樣品中，表達(dá)最穩(wěn)定，其次是RPL2，NADH表達(dá)變化最大；而NormFinder軟件

5、分析結(jié)果表明3個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參依次為RPL2、ACT、UBE，綜合上述結(jié)果，確定了以ACT、UBE和RPL2為內(nèi)參基因，將腈水解酶表達(dá)數(shù)據(jù)用IQ5軟件分析，分析結(jié)果表明，BjNIT1在接種根腫菌接種體后20天的病株根部，表達(dá)量開始增加，而在健株中到40天為止BjNIT1的表達(dá)量均處在較低水平；在40天時(shí)BjNIT1在病株中的表達(dá)量大約是在健株中表達(dá)量的50倍。在接種后10-30天間，BjNIT2在病株根部的表達(dá)量均低于健株，在20天時(shí)，差

6、異達(dá)到最大；在40天時(shí)，兩組中的BjNIT2的表達(dá)量幾乎相等。從接種后至30天為止，BjNIT4在病株根部的表達(dá)量沒(méi)有大的變化，而在40天時(shí)BjNIT4在病根中的表達(dá)量加倍。
　　用RACE技術(shù)擴(kuò)增腈水解酶基因cDNA全長(zhǎng)，利用SMART，Expasy等在線軟件分析推導(dǎo)的氨基酸序列的基本性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并利用Clustalx軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明所測(cè)得的745bp的BjNIT1序列包括390bp開放閱讀框，79bp的5'非翻譯

7、區(qū)和276bp的3'非翻譯區(qū)；696的BjNIT2序列包括390bp的開放閱讀框，63bp的5'非翻譯區(qū)和243bp的3'非翻譯區(qū)；1026的BjNIT4序列包括825bp的開放閱讀框，21bp的5'非翻譯區(qū)和180bp的3'非翻譯區(qū)。三個(gè)測(cè)得的腈水解酶序列均有加尾信號(hào)AATAAA和poly(A)尾巴。蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)和功能結(jié)構(gòu)域分析表明，擴(kuò)增的cDNA序列的5'端不完整。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示莖瘤芥腈水解酶與同屬植物蕪菁的親緣關(guān)系較近，其次是大