三角帆蚌貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin的生物礦化功能研究.pdf

1、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）是我國(guó)特有的淡水育珠蚌，近幾年來(lái)淡水珍珠產(chǎn)量的95％都是來(lái)自于三角帆蚌。在三角帆蚌的貝殼和珍珠的研究中，鑒定和分析基質(zhì)蛋白的組成和功能對(duì)理解其珍珠質(zhì)的形成機(jī)理具有非常重要的意義。以前所研究的貝殼基質(zhì)蛋白大都是從海水貝類中分離鑒定的，有關(guān)淡水貝類貝殼基質(zhì)蛋白的研究還比較少。本研究從三角帆蚌外套膜中分離鑒定得到了一個(gè)新的貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。
　

2、　1.對(duì)三角帆蚌silkmapin基因進(jìn)行了克隆、序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、組織表達(dá)分析及原位雜交檢測(cè)。運(yùn)用RACE技術(shù)得到該基因cDNA序列的全長(zhǎng)為1242bp，擁有一個(gè)978bp的開放閱讀框。該基因編碼一個(gè)30.89KD的蛋白質(zhì)，主要含有甘氨酸（Gly），占整個(gè)分量的34.41%，序列中所含的天冬氨酸（Asp）主要集中在C末端，推測(cè)silkmapin的C末端具有結(jié)合Ca2+的能力。二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)結(jié)果表明silkmapin主要為β折疊，高級(jí)結(jié)

3、構(gòu)為一細(xì)絲狀蛋白質(zhì)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明silkmapin只在外套膜的邊緣外褶和緣膜部的上皮細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果一致，在外套膜邊緣和緣膜部的上皮細(xì)胞中檢測(cè)到了強(qiáng)烈的信號(hào)，實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交的結(jié)果可以說(shuō)明silkmapin參與了三角帆蚌貝殼珍珠層和棱柱層的形成。
　　2.通過(guò)貝殼修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究silkmapin在貝殼生物礦化中的作用。將三角帆蚌進(jìn)行活體破殼處理，破殼的一邊作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)

4、設(shè)有兩個(gè)對(duì)照組，對(duì)外套膜組織和修復(fù)殼樣品進(jìn)行收集，修復(fù)出的新殼用以進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）觀察，外套膜組織樣品用以熒光定量表達(dá)分析。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示三角帆蚌貝殼生長(zhǎng)過(guò)程是由外而內(nèi)逐層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)順序依次為角質(zhì)層—棱柱層—珍珠層。薄薄的角質(zhì)層最先完成生長(zhǎng)，之后棱柱層文石晶體顆粒在角質(zhì)層表面生長(zhǎng)，棱柱層晶體生長(zhǎng)是在橫向和縱向兩個(gè)方向上同時(shí)進(jìn)行。棱柱層達(dá)到成熟后，片狀的正六邊形文石珍珠層晶體在其上開始堆積，從棱柱層生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向珍珠層時(shí)候無(wú)明

5、顯的過(guò)渡期。還發(fā)現(xiàn)棱柱層生長(zhǎng)符合“擠壓假說(shuō)”的特點(diǎn)，而珍珠層則是典型的“磚墻型”結(jié)構(gòu)。結(jié)合掃描電鏡觀察和在不同時(shí)期外套膜中表達(dá)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在棱柱層和珍珠層生長(zhǎng)的時(shí)期，silkmapin在破殼實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，說(shuō)明silkmapin的確參與了三角帆蚌貝殼棱柱層和珍珠層的礦化過(guò)程。
　　3.通過(guò)插片實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究silkmapin在三角帆蚌珍珠形成過(guò)程中的作用。選取了健康規(guī)格相同的三角帆蚌進(jìn)行無(wú)核珍珠插核手術(shù)，定期進(jìn)行珍

6、珠囊組織樣品采集和珍珠小顆粒的收集，珍珠囊組織樣品用以進(jìn)行熒光定量組織表達(dá)分析；珍珠小顆粒經(jīng)過(guò)處理后放在掃描電子顯微鏡（SEM）下進(jìn)行表面形貌的觀察。掃描電鏡觀察的結(jié)果表明三角帆蚌珍珠的礦化生長(zhǎng)過(guò)程分為碳酸鈣無(wú)序沉積和有序沉積兩個(gè)階段。這兩個(gè)階段珍珠顆粒的表面形貌變化也很明顯，從一開始的凹凸不平、雜亂堆積到后來(lái)的平整光滑、有序堆疊。結(jié)合電鏡觀察和在不同時(shí)期珍珠囊中表達(dá)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)silkmapin在珍珠成核期的表達(dá)量呈現(xiàn)一個(gè)逐步上升的趨