三角帆蚌珍珠形成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）是我國(guó)主要的淡水育珠蚌，其每年的淡水珍珠產(chǎn)量占世界的95％以上。研究三角帆蚌珍珠形成相關(guān)基因的功能對(duì)珍珠形成機(jī)制研究具有重要意義。通過(guò)三角帆蚌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的信息，篩選出2個(gè)perlucin基因和BMP7基因部分基因序列，采用RACE技術(shù)得到3個(gè)基因cDNA全長(zhǎng)序列。為研究這3個(gè)基因的功能，首先對(duì)7個(gè)管家基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，最終得到3個(gè)合適的內(nèi)參基因。利用熒光定量技術(shù)對(duì)3個(gè)基因在不同組織中

2、、貝殼修復(fù)過(guò)程中及早期珍珠形成過(guò)程中表達(dá)量進(jìn)行分析，利用原位雜交技術(shù)對(duì)基因在外套膜的表達(dá)進(jìn)行定位分析。嘗試將 Hc-perlucin1蛋白在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。主要的研究結(jié)果如下：
　　（1）三角帆蚌內(nèi)參基因的篩選
　　對(duì)β-actin、β-tubulin、elongation factor1 alpha（EF1α）、GAPDH、ubiquitin、ribosomal protein L18（Rpl18）以及cyclophi

3、lin共7個(gè)管家基因，采用BestKeeper，geNorm和NormFinder軟件分析了其在不同組織間、不同季節(jié)外套膜、貝殼修復(fù)過(guò)程和早期珍珠形成過(guò)程中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Ubi、RPL18和EF1α這3個(gè)管家基因在本論文所設(shè)置的實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，是作為研究三角帆蚌貝殼和珍珠形成中基因表達(dá)分析的合適內(nèi)參基因。
　?。?）2個(gè)perlucin基因的克隆及表達(dá)分析
　　克隆得到2個(gè)C型凝聚素基因Hc-perluc

4、in1和Hc-perlucin2，兩基因cDNA全長(zhǎng)分別是1460 bp和1973 bp，包括18 bp和438 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR），908 bp和972 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。分別可編碼161個(gè)和183個(gè)氨基酸，Hc-perlucin1基因有信號(hào)肽，而Hc-perlucin2基因無(wú)信號(hào)肽。兩個(gè)基因都含有6個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域。Hc-perlucin1和Hc-perlucin2基因在C端分別是―QPS

5、‖和―EPN‖，這說(shuō)明它們分別與半乳糖和甘露糖特異性結(jié)合。通過(guò)熒光定量分析，兩個(gè)基因在三角帆蚌9個(gè)組織中均有表達(dá)，在鰓、閉殼肌和外套膜表達(dá)量都比較高。除此之外，Hc-perlucin1在血細(xì)胞中的表達(dá)量也比較高，Hc-perlucin2基因在腸道中表達(dá)量較高。在貝殼修復(fù)過(guò)程中 Hc-perlucin1基因在珍珠層形成過(guò)程中表達(dá)量有明顯的上升，而 Hc-perlucin2基因表達(dá)量則有所下降。在早期珍珠形成過(guò)程中，兩個(gè)基因表達(dá)量都有明顯的

6、上升。原位雜交結(jié)果也顯示兩個(gè)基因在外套膜中的表達(dá)位置一致，都在外套膜外側(cè)上皮細(xì)胞中表達(dá)，該區(qū)域的細(xì)胞主要是參與珍珠層的形成。因此，三角帆蚌perlucin基因可能參與了珍珠層的形成。
　?。?）Hc-BMP7基因的克隆與表達(dá)分析
　　克隆得到Hc-BMP7基因cDNA全長(zhǎng)為2080 bp，包括377 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR）和401 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度是1287 bp，可編碼428個(gè)氨基酸

7、，前26個(gè)氨基酸是信號(hào)肽。Hc-BMP7含有一個(gè)TGF-β家族指紋，TGF-beta propeptide和TGFB兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。Hc-BMP7在9個(gè)組織中均有表達(dá)，其中以性腺、鰓、腎臟和外套膜的表達(dá)量較高。在貝殼修復(fù)過(guò)程和早期珍珠形成過(guò)程中，該基因在外套膜和珍珠囊中的表達(dá)量均沒(méi)有上調(diào)。原位雜交結(jié)果顯示該基因在外套膜外側(cè)上皮細(xì)胞和外套膜緣膜外褶上表達(dá)。
　　（4）Hc-perlucin1蛋白的原核表達(dá)
　　通過(guò) PCR擴(kuò)增得到

8、 Hc-perlucin1基因整個(gè)開(kāi)放閱讀框，與線性表達(dá)載體pET-28a連接組成重組載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白 pET-28a-Hc-perlucin1。通過(guò)不同梯度的培養(yǎng)溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示重組融合蛋白在最佳表達(dá)條件分別為：37℃、0.1 mmol/L IPTG、6 h。pET-28a-Hc-perlucin1重組融合蛋白主要以包涵體形式存在。通過(guò)SDS-