三角帆蚌基質(zhì)金屬蛋白酶基因的克隆、表達(dá)及創(chuàng)傷修復(fù)模型的構(gòu)建.pdf

1、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我國重要的淡水育珠蚌之一，育珠插核過程中傷口容易受到病原體侵染，使育珠蚌的吐核率升高，甚至造成蚌的死亡。因此，開展對其分子免疫及傷口修復(fù)機(jī)制的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　本文采用RACE PCR技術(shù)分別克隆出了三角帆蚌的基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-19（MMP-19）的cDNA序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2種基因在健康蚌血淋巴、肝胰臟、閉殼肌、

2、外套膜和鰓5種組織中的表達(dá)情況；以及嗜水氣單胞菌和肽聚糖（PGN）刺激后，2種基因在血液和肝胰臟中的表達(dá)變化；通過建立三角帆蚌創(chuàng)傷修復(fù)模型，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2種基因在傷口修復(fù)期間不同時(shí)間段的表達(dá)情況；利用原核表達(dá)技術(shù)對2種基因進(jìn)行了原核表達(dá)。
　　MMP1基因的cDNA全長序列為1822bp，其中5’UTR（非編碼區(qū)）有31bp；3’UTR有258bp；開放閱讀框（ORF）的堿基長度為1533bp，共編碼510個氨基

3、酸。經(jīng)Expasy在線網(wǎng)站的SignalP4.0分析氨基酸發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列，該蛋白理論分子量為58.28kDa，等電點(diǎn)為9.27?？寺〉玫降腗MP19基因序列長度2130bp，其中5’UTR29bp，3’UTR長度為532bp，開放閱讀框長度為1569bp，共編碼522氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列。推導(dǎo)的蛋白分子量為59.44kDa，等電點(diǎn)為6.83。
　　MMP1,19基因的mRNA在健康蚌的血液、外套膜、肌肉

4、、鰓和肝胰腺中均有表達(dá)。其中，MMP1和MMP19均在在血液中表達(dá)量最高。MMP1在嗜水氣單胞菌刺激后，在24h的血液和肝胰臟中均表達(dá)量極顯著性上升；在PGN誘導(dǎo)后3h的血液中極顯著性上調(diào)，在肝胰臟中表達(dá)量無顯著變化。MMP19經(jīng)PGN和嗜水氣單胞菌刺激后在肝臟中表達(dá)量變化不明顯，在血液中經(jīng)PGN誘導(dǎo)后MMP19表達(dá)量上調(diào)，在3h表達(dá)量最高。經(jīng)嗜水氣單胞菌刺激后MMP19在血液中呈上調(diào)趨勢，24h表達(dá)量最高。
　　MMP1基因在創(chuàng)

5、傷后的第3d表達(dá)量最高，MMP19基因在創(chuàng)傷后第1d表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的增加，2種基因的表達(dá)量呈降低趨勢，到達(dá)第15d時(shí)表達(dá)量恢復(fù)到初始水平。
　　將三角帆蚌MMP1,19基因的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體PET-28a利用BamHI、HindIII和EcoRI、HindIII雙酶切之后，連接并成功構(gòu)建了pET-28a-MMP1和pET-28a-MMP19原核表達(dá)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行原核