三角帆蚌創(chuàng)傷修復模型的構(gòu)建及重組TIMP的抑制功能研究.pdf

1、我國貝類養(yǎng)殖中，三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是重要的雙殼貝類之一，育珠插核過程中傷口容易受到病原體侵染，使育珠蚌的吐核率升高，甚至造成蚌的死亡。因此，開展對其分子免疫及傷口修復機制的研究具有重要的理論和實際意義。
　　本實驗采用RACE PCR技術(shù)克隆出了三角帆蚌2種金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP1、TIMP2）的cDNA序列，通過實時熒光定量PCR方法檢測2種基因在健康蚌鰓、外套膜、閉殼肌、血淋巴、肝胰臟5種

2、組織中的表達情況；以及嗜水氣單胞菌和肽聚糖（PGN）刺激后，2種基因在血液和肝胰臟中的表達變化；通過建立創(chuàng)傷修復模型，利用RT-PCR方法檢測2種基因在傷口修復期間各時間段的表達情況；利用原核表達技術(shù)對2種基因進行了原核表達，檢測了重組蛋白對金屬蛋白酶的抑制活性。
　　TIMP1基因的cDNA全長序列為1160 bp，其中5’UTR（非編碼區(qū)）有40bp；3’UTR有412bp；開放閱讀框（ORF）的堿基長度為708bp，由235

3、個氨基酸組成。經(jīng)Expasy在線網(wǎng)站的SignalP4.0分析氨基酸發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列，該蛋白理論分子量為27.26kDa，等電點為8.89，帶負電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）有26個，帶正電荷的殘基的總數(shù)（Arg+Lys）有35個?？寺〉玫降腡IMP2基因序列長度729bp，其中5’UTR38bp，3’UTR長度為238bp，開放閱讀框長度為453bp，共編碼150氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列。推導的蛋白分子量為16

4、.58kDa，等電點為8.72。帶負電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）為11，帶正電荷的殘基的總數(shù)（Arg+Lys）為15。
　　TIMP1,2基因的mRNA在健康蚌的血液、外套膜、肌肉、鰓和肝胰腺中均有表達。其中，TIMP1在血液中表達量最高，外套膜中最少。TIMP2在肌肉中表達量最高，其次是血液。嗜水氣單胞菌刺激后，TIMP1在24h的血液中表達量極顯著性上升，肝胰臟中表達無明顯變化；TIMP1在PGN刺激后6h的血液中極顯著性

5、上調(diào)，在肝胰臟中表達量無顯著變化。TIMP2經(jīng)PGN和嗜水氣單胞菌刺激后在肝臟中表達量變化不明顯，經(jīng)PGN刺激后在血液中表達量上調(diào)，在48h表達量最高。嗜水氣單胞菌刺激在血液中呈上調(diào)趨勢，3h表達量最高。
　　TIMP1,2基因在創(chuàng)傷后的第1d表達量最高，隨著時間的增加，2種基因的都具有降低趨勢的表達量，到達第15d時恢復到初始水平。
　　將三角帆蚌TIMP1,2基因的擴增產(chǎn)物和表達載體pET-32a利用ECORI、Hind