Notch信號途徑對小鼠骨髓單核來源樹突狀細胞和巨噬細胞分化發(fā)育的調控.pdf

1、單核細胞是機體先天性免疫和獲得性免疫應答的重要組成部分，是單核吞噬系統(tǒng)的主要成員之一。大量研究表明骨髓單核細胞是樹突狀細胞和巨噬細胞的共同前體細胞，他們共同構成了外來微生物入侵時機體的有效防御系統(tǒng)，同時對于生理狀態(tài)下清除機體內衰老和凋亡的細胞，維持機體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了不可替代的作用。樹突狀細胞是目前已知的功能最強大的抗原呈遞細胞，是體內激發(fā)T細胞免疫應答的首要環(huán)節(jié)。而巨噬細胞能夠吞噬細菌、病毒、凋亡的細胞及抗原抗體復合物等，并通過胞內溶酶體

2、等將其消化清除，同時巨噬細胞還具有較強的抗原處理和遞呈能力，能夠通過分泌多種細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)和介導炎癥反應。單核細胞，樹突狀細胞以及巨噬細胞的異常發(fā)育必然導致機體免疫系統(tǒng)功能和機體內環(huán)境的紊亂，最終引發(fā)機體的各種疾病。
　　細胞的分化是一個復雜的生命過程，其中涉及多種信號途徑的協(xié)同和調控。Notch信號途徑在進化中高度保守，從線蟲到人，從胚胎發(fā)育到成年個體的多種系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要作用。Notch受體和配體家族均是單次跨膜蛋白，

3、通過細胞間的相互作用，Notch受體胞內段發(fā)生水解入核，同時募集并結合多種蛋白分子形成轉錄共激活物，去除RBP-J的轉錄抑制作用，調控下游靶基因的表達。Notch信號途徑對多細胞生物的很多不同組織中的細胞命運起著決定性作用，例如神經系統(tǒng)，血管系統(tǒng)，造血系統(tǒng)等等。在免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程中，Notch信號途徑在多個環(huán)節(jié)參與了免疫細胞發(fā)育命運的選擇，如T/B細胞的分化、脾臟中邊緣帶B細胞和濾泡B細胞的分化等等。同時，Notch信號途徑也是Th1

4、和Th2免疫反應選擇的調控因素之一。但Notch信號途徑在其他免疫類型細胞諸如DC、巨噬細胞以及NK細胞發(fā)育的調控作用尚不十分清楚。雖然有報道顯示阻斷Notch信號途徑可以抑制DC的發(fā)育，然而對于調控過程中的分子機制卻是知之甚少。
　　為了更加全面闡明Notch信號途徑在免疫系統(tǒng)發(fā)育過程的調控作用，本課題利用條件性基因剔除技術，在小鼠造血干細胞中誘導剔除Notch信號途徑的關鍵性轉錄因子RBP-J，在造血系細胞中徹底阻斷Notch

5、信號途徑。通過RBP-J剔除后對單核細胞，DC和巨噬細胞發(fā)育及功能變化的深入探討，進一步明確了Notch信號途徑調控單核細胞命運選擇中的作用，以及對DC和巨噬細胞功能的影響，并分析了相關的分子機制。
　　主要研究成果如下：
　　1．通過交配Mx-Cre轉基因小鼠和RBP-Jflox/flox條件基因剔除小鼠，最終得到了同時攜帶Mx-Cre×RBP-Jflox/flox的雙轉基因條件剔除小鼠。經polyI-C誘導8-12周后得

6、到RBP-J基因剔除小鼠。經Southernblot鑒定，骨髓中RBP-J剔除效率約接近100％。通過骨髓移植實驗表明，剔除RBP-J使單核細胞在體內向DC方向的分化受到明顯抑制，而向巨噬細胞方向的分化得到加強。體外的細胞誘導分化實驗也印證了體內的實驗結果。分子生物學檢測表明RBP-J-/-巨噬細胞表達M-CSFR水平明顯升高，提示Notch信號途徑可能是通過直接或間接調控M-CSFR的表達調控單核細胞的分化方向。
　　2．在DC

7、中剔除RBP-J后，用LPS將不能有效刺激DC的發(fā)育成熟，DC發(fā)育停留在突起較少、MHCII表達較低的不成熟階段，同時其遷移和抗原呈遞功能受到損傷。進一步研究表明，趨化因子受體CXCR4是Notch信號途徑下游的間接靶分子，在DC的發(fā)育過程中可以促進DC突起的長出和MHCII分子的表達。用慢病毒在RBP-J-/-DC中過表達CXCR4可以挽救由阻斷Notch信號途徑所引起的缺陷表型。我們的研究結果首次揭示了Notch信號可以通過調控CX

8、CR4促進DC發(fā)育成熟。
　　3．剔除RBP-J后，巨噬細胞在LPS刺激后不能向M1型巨噬細胞極化，而是被極化為M2型巨噬細胞，其遷移、吞噬、抗原加工以及呈遞能力減退，失去了維持機體穩(wěn)態(tài)的功能。在腫瘤中，RBP-J-/-巨噬細胞腫瘤殺傷功能減弱，腫瘤重量和體積沒有因為巨噬細胞的存在受到抑制。免疫組化結果顯示，RBP-J-/-巨噬細胞可以促進腫瘤中新生血管的生成，表明其具有腫瘤相關性巨噬細胞（TAM）的特性。同時，激活巨噬細胞中的N

9、otch信號途徑可以增強細胞的抗原呈遞能力，并激發(fā)較強的Th1型免疫應答。這些結果表明Notch信號途徑是巨噬細胞M1/M2極化的關鍵調控信號。
　　綜上所述，我們首次通過RBP-J條件性基因剔除小鼠，觀察了Notch/RBP-J信號對于小鼠單核細胞來源DC和巨噬細胞發(fā)育和功能的調控作用。我們的結果表明，Notch信號參與調控單核細胞發(fā)育命運的方向；通過調控CXCR4的表達促進DC的成熟；同時對于巨噬細胞向M1方向極化是必須的。以