Notch信號(hào)途徑對(duì)小鼠骨髓單核來源樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控.pdf

1、單核細(xì)胞是機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分，是單核吞噬系統(tǒng)的主要成員之一。大量研究表明骨髓單核細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共同前體細(xì)胞，他們共同構(gòu)成了外來微生物入侵時(shí)機(jī)體的有效防御系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)于生理狀態(tài)下清除機(jī)體內(nèi)衰老和凋亡的細(xì)胞，維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了不可替代的作用。樹突狀細(xì)胞是目前已知的功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，是體內(nèi)激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)。而巨噬細(xì)胞能夠吞噬細(xì)菌、病毒、凋亡的細(xì)胞及抗原抗體復(fù)合物等，并通過胞內(nèi)溶酶體

2、等將其消化清除，同時(shí)巨噬細(xì)胞還具有較強(qiáng)的抗原處理和遞呈能力，能夠通過分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的異常發(fā)育必然導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂，最終引發(fā)機(jī)體的各種疾病。
　　細(xì)胞的分化是一個(gè)復(fù)雜的生命過程，其中涉及多種信號(hào)途徑的協(xié)同和調(diào)控。Notch信號(hào)途徑在進(jìn)化中高度保守，從線蟲到人，從胚胎發(fā)育到成年個(gè)體的多種系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要作用。Notch受體和配體家族均是單次跨膜蛋白，

3、通過細(xì)胞間的相互作用，Notch受體胞內(nèi)段發(fā)生水解入核，同時(shí)募集并結(jié)合多種蛋白分子形成轉(zhuǎn)錄共激活物，去除RBP-J的轉(zhuǎn)錄抑制作用，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。Notch信號(hào)途徑對(duì)多細(xì)胞生物的很多不同組織中的細(xì)胞命運(yùn)起著決定性作用，例如神經(jīng)系統(tǒng)，血管系統(tǒng)，造血系統(tǒng)等等。在免疫系統(tǒng)的發(fā)育過程中，Notch信號(hào)途徑在多個(gè)環(huán)節(jié)參與了免疫細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)的選擇，如T/B細(xì)胞的分化、脾臟中邊緣帶B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞的分化等等。同時(shí)，Notch信號(hào)途徑也是Th1

4、和Th2免疫反應(yīng)選擇的調(diào)控因素之一。但Notch信號(hào)途徑在其他免疫類型細(xì)胞諸如DC、巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控作用尚不十分清楚。雖然有報(bào)道顯示阻斷Notch信號(hào)途徑可以抑制DC的發(fā)育，然而對(duì)于調(diào)控過程中的分子機(jī)制卻是知之甚少。
　　為了更加全面闡明Notch信號(hào)途徑在免疫系統(tǒng)發(fā)育過程的調(diào)控作用，本課題利用條件性基因剔除技術(shù)，在小鼠造血干細(xì)胞中誘導(dǎo)剔除Notch信號(hào)途徑的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-J，在造血系細(xì)胞中徹底阻斷Notch

5、信號(hào)途徑。通過RBP-J剔除后對(duì)單核細(xì)胞，DC和巨噬細(xì)胞發(fā)育及功能變化的深入探討，進(jìn)一步明確了Notch信號(hào)途徑調(diào)控單核細(xì)胞命運(yùn)選擇中的作用，以及對(duì)DC和巨噬細(xì)胞功能的影響，并分析了相關(guān)的分子機(jī)制。
　　主要研究成果如下：
　　1．通過交配Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和RBP-Jflox/flox條件基因剔除小鼠，最終得到了同時(shí)攜帶Mx-Cre×RBP-Jflox/flox的雙轉(zhuǎn)基因條件剔除小鼠。經(jīng)polyI-C誘導(dǎo)8-12周后得

6、到RBP-J基因剔除小鼠。經(jīng)Southernblot鑒定，骨髓中RBP-J剔除效率約接近100％。通過骨髓移植實(shí)驗(yàn)表明，剔除RBP-J使單核細(xì)胞在體內(nèi)向DC方向的分化受到明顯抑制，而向巨噬細(xì)胞方向的分化得到加強(qiáng)。體外的細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)也印證了體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分子生物學(xué)檢測(cè)表明RBP-J-/-巨噬細(xì)胞表達(dá)M-CSFR水平明顯升高，提示Notch信號(hào)途徑可能是通過直接或間接調(diào)控M-CSFR的表達(dá)調(diào)控單核細(xì)胞的分化方向。
　　2．在DC

7、中剔除RBP-J后，用LPS將不能有效刺激DC的發(fā)育成熟，DC發(fā)育停留在突起較少、MHCII表達(dá)較低的不成熟階段，同時(shí)其遷移和抗原呈遞功能受到損傷。進(jìn)一步研究表明，趨化因子受體CXCR4是Notch信號(hào)途徑下游的間接靶分子，在DC的發(fā)育過程中可以促進(jìn)DC突起的長出和MHCII分子的表達(dá)。用慢病毒在RBP-J-/-DC中過表達(dá)CXCR4可以挽救由阻斷Notch信號(hào)途徑所引起的缺陷表型。我們的研究結(jié)果首次揭示了Notch信號(hào)可以通過調(diào)控CX

8、CR4促進(jìn)DC發(fā)育成熟。
　　3．剔除RBP-J后，巨噬細(xì)胞在LPS刺激后不能向M1型巨噬細(xì)胞極化，而是被極化為M2型巨噬細(xì)胞，其遷移、吞噬、抗原加工以及呈遞能力減退，失去了維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的功能。在腫瘤中，RBP-J-/-巨噬細(xì)胞腫瘤殺傷功能減弱，腫瘤重量和體積沒有因?yàn)榫奘杉?xì)胞的存在受到抑制。免疫組化結(jié)果顯示，RBP-J-/-巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤中新生血管的生成，表明其具有腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（TAM）的特性。同時(shí)，激活巨噬細(xì)胞中的N

9、otch信號(hào)途徑可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗原呈遞能力，并激發(fā)較強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答。這些結(jié)果表明Notch信號(hào)途徑是巨噬細(xì)胞M1/M2極化的關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)。
　　綜上所述，我們首次通過RBP-J條件性基因剔除小鼠，觀察了Notch/RBP-J信號(hào)對(duì)于小鼠單核細(xì)胞來源DC和巨噬細(xì)胞發(fā)育和功能的調(diào)控作用。我們的結(jié)果表明，Notch信號(hào)參與調(diào)控單核細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)的方向；通過調(diào)控CXCR4的表達(dá)促進(jìn)DC的成熟；同時(shí)對(duì)于巨噬細(xì)胞向M1方向極化是必須的。以