馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的qRt-PCR檢測(cè)及其遺傳進(jìn)化分析.pdf

1、馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是影響中國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的重要病原，一般可引起馬鈴薯植株矮化，葉片皺縮，塊莖變小、畸形，產(chǎn)量下降等。該病害可以通過(guò)機(jī)械、無(wú)性繁殖以及實(shí)生種子等多種途徑傳播。目前，中國(guó)有很多馬鈴薯育種材料（包括種質(zhì)資源和育成的品系等）已經(jīng)感染了PSTVd，而PSTVd又很難通過(guò)莖尖組織培養(yǎng)脫除，且可以通過(guò)種子傳遞給下一代，因此，PSTVd已經(jīng)給中國(guó)馬鈴薯育種工作帶來(lái)了極

2、大的困擾，更給馬鈴薯育種工作埋下了巨大的隱患。目前，防治的主要方法是生產(chǎn)健康（無(wú)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒）的脫毒馬鈴薯種薯。在馬鈴薯種薯的生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)脫毒馬鈴薯種薯/苗進(jìn)行田間、庫(kù)房和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是種薯/苗質(zhì)量控制的最基本、最關(guān)鍵和最重要的手段。目前，中國(guó)在PSTVd研究方面存在以下幾方面問(wèn)題:(1)PSTVd檢測(cè)技術(shù)體系尚不完善;(2)中國(guó)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒發(fā)生、系統(tǒng)發(fā)育情況及致病力尚不十分清楚;(3)不同馬鈴薯品種感染PSTVd的癥

3、狀復(fù)雜、不明確等。針對(duì)以上問(wèn)題，開展了系列研究，并取得了以下結(jié)果:
　　(1)建立了PSTVd的qRT-PCR檢測(cè)體系:設(shè)計(jì)了3組引物并從中篩選出最適引物對(duì)PSTV-234F和PSTV-356R。利用這對(duì)引物，結(jié)合設(shè)計(jì)的Taqman探針(PSTV-251T)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了PSTVd的qRT-PCR檢測(cè)體系。該檢測(cè)體系不僅具有很高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)極限為31.1拷貝/μL（101.17 ag/μL），而且具有非常好的穩(wěn)定

4、性。這一體系已經(jīng)被成功地應(yīng)用到馬鈴薯樣品的檢測(cè)。該體系的建立不僅豐富了PSTVd的檢測(cè)手段，而且能夠進(jìn)一步提高PSTVd檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
　　(2) PSTVd發(fā)生情況調(diào)查及中國(guó)分離物的序列分析:2009年～2014年間，對(duì)1000余份馬鈴薯種薯/苗樣本進(jìn)行了PSTVd調(diào)查，結(jié)果顯示，在此期間，PSTVd每年都有發(fā)生，平均感染率為6.5％。本研究測(cè)定了來(lái)自黑龍江、吉林、遼寧、山東、內(nèi)蒙古和陜西共6個(gè)省份的71個(gè)不同樣本中的PSTVd

5、序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)分離物中至少含有一種主流序列，共獲得74條主流序列。這些主流序列包含42種不同的序列變體(Accession numbersKR611334～KR611376)。BLAST結(jié)果表明，在42種不同的序列變體中，有12種與GenBank中登錄的PSTVd的序列相同，而其余30種則是新的PSTVd變體，目前僅從中國(guó)分離得到。這些序列的獲得為理解PSTVd的傳入、流行、遺傳變異等問(wèn)題奠定了基礎(chǔ)。首先，分析了中國(guó)流行的PS

6、TVd序列變體，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)流行的變體與其他國(guó)家的PSTVd分離物具有很高的序列相似性或者完全一致;其次，在中國(guó)，除弱毒株系外，從中國(guó)還分離到3種PSTVd中間株系，表明PSTVd中國(guó)分離物具有不同的致病性;此外，對(duì)獲得的42種不同的PSTVd序列變體與GenBank中登錄的165條自然條件下分離出PSTVd的序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。整體上，PSTVd可以被分成兩組（第1組和第Ⅱ組），第Ⅱ組能夠被進(jìn)一步分為三個(gè)亞組（亞組A～C）。所有的中

7、國(guó)PSTVd分離物均被包含在第Ⅱ組，而且總是與俄羅斯的分離物聚在一起，這表明中國(guó)和俄羅斯的PSTVd可能具有相同的起源。最后，對(duì)42種不同的中國(guó)PSTVd變體的突變位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分的變體通過(guò)一個(gè)位點(diǎn)的突變就可以聯(lián)系到一起，這表明突變可能是中國(guó)PSTVd分離物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿Α?br>　　(3) PSTVd中國(guó)分離物的致病性驗(yàn)證及不同馬鈴薯品種感染PSTVd的癥狀表現(xiàn)。將PSTVd中國(guó)分離物接種到4個(gè)馬鈴薯主栽品種（荷蘭15

8、，夏坡地，克新18和尤金）后，觀察癥狀表現(xiàn)，調(diào)查株高、葉片、單株產(chǎn)量、塊莖外觀等指標(biāo)。觀察發(fā)現(xiàn)4個(gè)品種均不同程度地表現(xiàn)出植株矮化、葉片皺縮、塊莖變小、產(chǎn)量降低和塊莖畸形等癥狀。說(shuō)明這4個(gè)馬鈴薯品種對(duì)PSTVd的侵染均是敏感的。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，感病植株的平均株高降低30.1％，平均單株產(chǎn)量降低40.2％。這些結(jié)果表明:雖然PSTVd中國(guó)分離物可能是弱毒株系，但其對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)仍然具有嚴(yán)重的影響。此外，不同品種感染PSTVd后有

9、不同的癥狀表現(xiàn)，在進(jìn)行田間和庫(kù)房檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意品種之間的差異。
　　總之，本研究建立了PSTVd qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)體系，提高了PSTVd的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性;通過(guò)多年的調(diào)查與分析掌握了目前PSTVd在中國(guó)北方的發(fā)生情況;通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)中國(guó)PSTVd分離物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，基本掌握了PSTVd中國(guó)分離物的分子進(jìn)化關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育情況;通過(guò)PSTVd接種馬鈴薯鑒定，推測(cè)了PSTVd中國(guó)分離物的致病力情況，并了解了不同馬鈴薯品種感染