qRT-PCR檢測馬立克氏病病毒gL、gI和meq基因mRNA方法的建立.pdf

1、馬立克氏病病毒I型(MDV-1)在雞體內的感染分為四個期：早期溶細胞感染期(early cytolytic infection)、潛伏期(latency)、第二次溶細胞期（secondary cytolytic infection）和腫瘤形成期(development of tumors)。不同毒力MDV-1的潛伏期存在明顯差異，vMDV開始于6、7、8dpi，vvMDV開始于10-14dpi，而vv+MDV開始于14-16dpi。gL

2、和gI蛋白是MDV的兩種囊膜蛋白，在溶細胞期大量表達，而在潛伏期極少表達；meq(Marek'sEcoRI Q)是MDV-1特有的致瘤基因之一，主要在潛伏期表達。因此，gL、gI和meq基因的mRNA轉錄水平可以作為判斷MDV感染期的指標。
　　 病毒編碼的microRNA(miRNA)于2004年被首次發(fā)現(xiàn)。MDV編碼的miRNA(mdv-miR)M4被證明與腫瘤的發(fā)生有密切關系并能調節(jié)免疫反應；miR-6～miR-8則推測是

3、源于LAT的miRNA，可以下調細胞的轉化生長因子的表達，具有抗細胞凋亡的作用。這些研究成果證明，mdv-miRNA與腫瘤的發(fā)生存在著密切關系，腫瘤特異性和組織特異性的miRNA表達譜可作為細胞轉化的重要生物學指標。為了研究不同毒力MDV編碼的miRNAs在感染的潛伏期(latency)的表達差異，課題試圖建立用于檢測MDV-lgL、gI和meq基因mRNA的熒光定量PCR(quantitative reverse-transcript

4、ase PCR，qRT-PCR)方法，為以這些基因在感染細胞內mRNA轉錄水平作為為識別病毒溶細胞期和潛伏期的指標提供工具。
　　 參照已發(fā)表的資料而設計的引物，以感染vvMDV廣西分離株YL040920的雞胚成纖維細胞單層(CEF)基因組DNA為模板進行PCR，擴增出包含gL、gI、meq以及內參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的長片段產物

5、，純化后連接pGM-T載體，轉化大腸桿菌后，篩選陽性克隆，增菌抽提質粒。通過PCR和測序檢驗，證明已成功構建pGM-T-gL、paM-T-gI、pGM-T-meq和pGM-T-GAPD，重組質粒，可作為下一步構建標準曲線用的標準品使用。
　　 利用Primer6.0軟件，針對YL040920株的gL、gI、meq和GAPDH基因序列的保守區(qū)域設計了4對特異性引物，用于構建qRT-PCR標準曲線和樣品檢測。以10倍梯度濃度的gL、

6、gI、meq和GAPDH基因重組質粒標準品DNA為模板進行SYBR Green I法qPCR反應，建立了相應的標準曲線及其直線回歸方程。在該反應體系和反應條件下，4條標準曲線的靈敏度達到10-1000copies/μL，標準曲線的Ct值與標準品濃度的對數(shù)值之間存在良好的線性關系，相關系數(shù)(R2)均超過0.98。結果表明，已成功建立了檢測MDV-1感染雞體內基因gL、gI、meq和GAPDH基因mRNA的動態(tài)變化的qRT-PCR標準曲線。