棉花生殖發(fā)育相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)和功能分析.pdf

1、棉花是具有戰(zhàn)略意義的農(nóng)作物，如何提高棉花產(chǎn)量、改善棉花品質(zhì)，歷來(lái)受到了研究者的高度重視。由于棉花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要通過(guò)其生殖器官的發(fā)育好壞體現(xiàn)，因此對(duì)其生殖發(fā)育進(jìn)行深入研究，將是實(shí)現(xiàn)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花的重要突破口。 本論文根據(jù)以往的研究，推斷在緊密連鎖且同在生殖器官中特異表達(dá)的arf1和nodulin-like基因附近存在著一個(gè)與生殖發(fā)育相關(guān)的基因簇。從這一推斷著手，開(kāi)展了相應(yīng)的研究，以期能夠深入認(rèn)識(shí)棉花的生殖發(fā)育機(jī)理，為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花

2、的培育提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 首先，根據(jù)已知的arf1和nodulin-like基因設(shè)計(jì)了三對(duì)PCR引物，通過(guò)PCR池篩法對(duì)棉花18RBAC文庫(kù)進(jìn)行了篩選，獲得了兩個(gè)包含這兩個(gè)基因的BAC克隆G2-J-15和G128-K-15，通過(guò)酶切鑒定其插入片段大小分別為38kb和90kb。選取了插入片段較小的G2-J-15進(jìn)行了全序列測(cè)序。 通過(guò)對(duì)G2-J-15的全序列測(cè)序和相關(guān)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在短短的38kb序列中一

3、共分布了7個(gè)基因，平均每5kb就存在一個(gè)基因，說(shuō)明該基因簇位于基因富集區(qū)。除了已知的arf1和nodulin-like基因外，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和BLAST，還發(fā)現(xiàn)了未在棉花中克隆過(guò)的GhGolS(肌醇半乳糖苷合酶基因)、GhAPm(AP復(fù)合體μ亞基基因)、GhPsbP(PSⅡ放氧復(fù)合體外周蛋白基因)和GhNeuF(中性β-呋喃果糖苷酶基因)，此外，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未在任何物種中發(fā)現(xiàn)過(guò)的未知基因。對(duì)這5個(gè)新基因進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，了

4、解了它們的基因結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能也有了一定的了解。對(duì)這些基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，即GhGolS、GhAPm和GhNeuF在棉花基因組中的排列順序和方向與其在擬南芥中同源基因的排列順序和方向一模一樣，甚至棉花GhAPm和GhNeuF基因之間間隔了兩個(gè)基因，而擬南芥中與之同源的基因之間同樣間隔了兩個(gè)基因。該基因簇在結(jié)構(gòu)上異常的保守性預(yù)示著該基因簇的功能可能也非常保守，對(duì)棉花的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用

5、。 利用real-timePCR對(duì)這5個(gè)棉花中新發(fā)現(xiàn)的基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)研究，建立了各基因的時(shí)空表達(dá)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除GhPsbP基因由于是棉花PSⅡOEC的外周蛋白而在葉片中特異表達(dá)以外，其它四個(gè)基因都在棉花生殖相關(guān)組織中特異表達(dá)：GhGolS基因在花藥和35dpa棉纖維中特異表達(dá)，GhAPm基因在30dpa棉纖維中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)，未知基因在花藥中的表達(dá)量最高，GhNeuF基因在花藥和25dpa棉纖維中的表達(dá)量最高。結(jié)合以前arf1

6、和nodulin-like基因在棉花生殖器官中特異表達(dá)的研究結(jié)果，證實(shí)了該區(qū)域所存在的由7個(gè)基因組成的緊密功能基因簇正如前面所推論的那樣與棉花生殖發(fā)育相關(guān)。 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆得到了GhGolS和GhAPm的cDNA，其全長(zhǎng)分別為1816和1590bp。GhGolS前面的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果除了錯(cuò)將一段90bp的外顯子預(yù)測(cè)為內(nèi)含子外，其結(jié)果與GhGolS的cDNA基本一致，GhAPm的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果則和其cDNA克隆完全一致。

7、 針對(duì)GhGolS和未知基因構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體，構(gòu)建了沉默棉花GhGolS和未知基因的RNAi載體，構(gòu)建了沉默擬南芥AtGolS2和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi載體，構(gòu)建了同時(shí)沉默擬南芥針AtGolS2、AP復(fù)合體μ亞基基因和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi載體，將其分別轉(zhuǎn)化棉花和擬南芥，獲得了擬南芥的T1代轉(zhuǎn)基因植株的種子，而針對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因棉花的篩選也在進(jìn)行。各類轉(zhuǎn)基因植株的獲得為對(duì)該基因簇進(jìn)行深入研究，了解其在棉花生殖