雞卵泡發(fā)育相關(guān)基因和miRNA的鑒定及功能分析.pdf

1、動物育種實踐證明，性早熟性狀可以遺傳，可能存在控制性早熟的主效基因，因此利用性早熟地方雞品種篩選性早熟相關(guān)基因，可用于動物培育性早熟高繁殖力的品種以及為人類性早熟疾病的控制和治療提供參考。動物性成熟是一個受多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，在哺乳動物進行了大量研究，但禽類相對較少。雞的卵泡在發(fā)育成熟過程中有嚴(yán)格的等級性，卵泡一旦經(jīng)過選擇后就按等級發(fā)育直至排卵，且很少發(fā)生閉鎖。提高進入優(yōu)勢化等級的卵泡數(shù)量對于提高雞的產(chǎn)蛋性能具有重要的經(jīng)濟意義。目前對

2、雞卵泡優(yōu)勢化選擇及等級化維持的分子機制大多仍不清楚。哺乳動物研究表明，有多種生長因子以自分泌/旁分泌的方式在促性腺激素協(xié)同下參與了卵泡發(fā)育調(diào)控。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的具有許多調(diào)控功能的一類非編碼小分子RNA，其在哺乳動物卵巢中的表達特征已有報道，但在禽類卵巢的表達及功能研究尚未見報道。本研究對雞卵泡發(fā)育相關(guān)基因及miRNA進行了鑒定和功能分析。
　　 一、雞FSHR基因5’調(diào)控區(qū)-237和-868兩個突變位點的多態(tài)性及功能分析

3、
　　 促卵泡素（FSH）是調(diào)控動物繁殖活動的重要激素之一，對動物卵巢卵泡的生長、發(fā)育、分化、成熟和排卵起著必不可少的作用，其生物學(xué)功能的發(fā)揮要通過位于靶細胞膜上的促卵泡素受體（FSHR）介導(dǎo)，研究FSHR5’調(diào)控區(qū)突變與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系，尋找繁殖相關(guān)的DNA分子標(biāo)記，對于禽類育種實踐將有著重要的現(xiàn)實意義。
　　 本研究用5個品種分析了突變位點的基因型分布，用2個雞品種共計943個個體進行了突變位點基因型和單倍型的檢測以及

4、與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析，用實時熒光定量PCR技術(shù)對突變位點TTG+G+、TTG+G-和TTG-G-三種不同基因型間FSHR mRNA的表達量進行分析，構(gòu)建4種單倍型載體，體外轉(zhuǎn)染雞的卵泡顆粒細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對其啟動基因表達的效率進行了分析。5個品種比較的結(jié)果表明：-868位點200 bp缺失型（G-）頻率在地方品種達90％以上；文昌雞群體單位點多態(tài)與39 w產(chǎn)蛋數(shù)和開產(chǎn)日齡相關(guān)不顯著，兩位點雙倍型分析結(jié)果與開產(chǎn)日齡相關(guān)密

5、切，TTG+G-對應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡（123 d），TTG+G+對應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡（134 d），兩者差異顯著（P=0.016）。新楊褐群體在-237位點為TT型時-868位點與37 w產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)顯著（P<0.05）：G-型對應(yīng)較早開產(chǎn)日齡，但G+型對應(yīng)較高的后期產(chǎn)蛋數(shù)；熒光定量結(jié)果也表明，高峰期G+G+型FSHR mRNA的表達量最高（P<0.05）。熒光素酶的分析結(jié)果表明，AG-型的啟動效率最高，顯著高于TG+、TG-單倍型（P=0.

6、015）。推測G-型可能與早開產(chǎn)有關(guān)，這與G-在開產(chǎn)較早的地方品種中的頻率較高相一致，G+型與高的產(chǎn)蛋數(shù)有關(guān)，其在高產(chǎn)群體中頻率較高，兩位點間的作用機理還有待于進一步研究。
　　 二、TNRC6A（又稱GW182）參與RNAi（RNA干擾）和miRNA途徑，與mRNA、Argonaute等蛋白聚集在細胞質(zhì)小體（P body或GW-body），參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。本研究分析了TNRC6A基因在下丘腦、輸卵管、肝臟及卵巢和卵泡發(fā)育不同時

7、期的表達規(guī)律。實時熒光定量結(jié)果顯示，TNRC6A mRNA在17 w自來航雞卵巢比23 w開產(chǎn)后卵巢的表達量呈現(xiàn)下調(diào)，而在下丘腦、肝臟及輸卵管中則上調(diào)表達（P<0.05）。在直徑4 mm的白卵泡中表達量最高，且跟其它幾級卵泡差異顯著（P<0.05），在直徑6-8mm的黃卵泡中表達量最低，之后隨卵泡直徑的增大而呈增高趨勢，在排卵前最大的F1卵泡中表達量又有所下降，但從黃卵泡到F1卵泡TNRC6A mRNA表達量差異不顯著。
　　

8、三、cDNA.-FLP技術(shù)是一種新的研究基因差異表達的技術(shù)，具有可靠性高、重復(fù)性好、假陽性率低、不需要預(yù)先知道序列信息及所需儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點，而被廣泛用于生物基因表達特性的研究。本研究用cDNA-AFLP方法，以具有性早熟特性的濟寧百日雞為試驗材料，篩選與性早熟有關(guān)的基因。使用EcoRI和MseI雙酶切組合，用54對不同的引物組合擴增出403個差異顯示片段，經(jīng)差異帶挖取，二次擴增，膠回收純化及克隆測序后，得到27個與GenBank數(shù)據(jù)

9、庫高度同源的差異表達序列。
　　 選擇可能與繁殖有關(guān)的13個差異顯示基因進行熒光定量驗證，最終獲得5個在表達量上有顯著差異的基因，其中有4個差異基因在開產(chǎn)的卵巢中表達上調(diào)，功能分析發(fā)現(xiàn)CCT6A與孕酮的產(chǎn)生有關(guān)，ERCC8基因所編碼的蛋白是miRNA的靶蛋白，ZNF183是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的重要轉(zhuǎn)錄因子，最初在爪蟾卵母細胞發(fā)現(xiàn)，Poly（A）polymeraseⅡ?qū)τ诼涯讣毎某墒煊兄匾饔?。在開產(chǎn)的卵巢明顯下調(diào)的LOC4188

10、83，其功能類似于酵母的vacuolar protein sorting36，下一步將對這些在性成熟前后卵巢中存在明顯表達差異基因的功能進行深入探討。
　　 四、采用Solexa測序技術(shù)分析了開產(chǎn)前后雞卵巢差異表達的mRNA。采集3只42 d雛雞和3只23 w產(chǎn)蛋白來航雞的卵巢組織，混池測序，結(jié)果在開產(chǎn)的卵巢共篩選到差異表達的mRNA3648個，其中有2088個呈下調(diào)表達，1560個呈上調(diào)表達，對測得的差異表達基因進行分析驗證，

11、為篩選性成熟相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。
　　 五、采用Solexa測序技術(shù)分析了開產(chǎn)前后雞卵巢差異表達的miRNA。采集3只42d雛雞和3只23 w產(chǎn)蛋白來航雞的卵巢組織，混池測序，結(jié)果共篩選到72個差異表達miRNA，其中34個上調(diào)表達，38個下調(diào)表達。在未開產(chǎn)雞的卵巢中篩選到189個新miRNA，在開產(chǎn)雞的卵巢中篩選到97個新miRNA。對獲得的差異表達miRNA進行分析驗證，為進一步研究miRNA在雞卵泡發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。