白藜蘆醇與美滿霉素對(duì)LPS所致大鼠黒質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景與目的：帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種常見(jiàn)于中老年人的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，隨著社會(huì)人口老齡化，發(fā)病率逐漸增加。PD的病因及確切發(fā)病機(jī)制至今不明，因此尚缺乏有效的根治策略。目前臨床上應(yīng)用的治療方法主要是以左旋多巴替代治療為主的癥狀性治療，但這種治療措施只能緩解癥狀，卻不能阻止疾病進(jìn)展，且隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，藥效逐漸下降，還常常出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的精神和經(jīng)濟(jì)

2、負(fù)擔(dān)。因此，人們熱切期待著開(kāi)發(fā)出更有效的治療PD藥物。近年來(lái)隨著人們對(duì)PD研究的不斷深入，以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到重視。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，正常情況下它起到免疫監(jiān)視作用。但是在腦部外傷或者遇到免疫刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞易被激活，并且釋放多種毒性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-1β（interleukin-1β，IL-

3、1β），花生四烯酸代謝產(chǎn)物，一氧化氮和反應(yīng)性氧自由基等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡。因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活為主的炎癥反應(yīng)，或減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的神經(jīng)毒性細(xì)胞因子，可以部分地防止DA能神經(jīng)元變性，阻止PD的進(jìn)展。這是抗炎藥物研究成為近年P(guān)D研究熱點(diǎn)的原因之一。本研究通過(guò)黑質(zhì)內(nèi)注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）制作PD動(dòng)物模型，應(yīng)用具有抗炎作用的中藥白藜蘆醇及美滿霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)，采用免疫組化方法及免疫印跡技術(shù)等觀

4、察二者對(duì)LPS所致大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用、對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活及NF-κB活性的影響。目的是觀察白藜蘆醇及美滿霉素對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用，并對(duì)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討，為開(kāi)發(fā)新的PD治療藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。至今相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。 方法：取48只雄性SD大鼠，體重200-250克，隨機(jī)分成4組：（1）對(duì)照組：黑質(zhì)內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）PD組：黑質(zhì)內(nèi)注射LPS，生理鹽水灌胃。（3）Res治療組：黑質(zhì)內(nèi)注射L

5、PS，Res灌胃。（4）MC治療組：黑質(zhì)內(nèi)注射LPS，MC灌胃。黑質(zhì)內(nèi)立體定向注射5ug LPS或PBS，Res、MC及PD組在注射LPS前3h開(kāi)始灌胃，劑量分別為20mg/kg/d、45mg/kg/d，PD組灌等量生理鹽水，持續(xù)到注射后14d。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)腹腔內(nèi)注射阿樸嗎啡（Apomorphine，APO）來(lái)觀察大鼠行為學(xué)變化，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）及NF-κB

6、的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；免疫印跡法檢測(cè)黑質(zhì)TH及NF-κB蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)各組大鼠在阿樸嗎啡注射后均可誘發(fā)向右側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為，對(duì)照組無(wú)任何行為變化。PD組大鼠30min平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為196.90±9.52，MC組及Res組30min平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為120.03±10.50、106.57±7.89，與PD組相比，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少（P<0.01）。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)各組黑質(zhì)均檢測(cè)到數(shù)量不同的TH陽(yáng)性神經(jīng)元。與對(duì)

7、照組相比，PD組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，甚至消失（P<0.01）。Res組及MC組黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與PD組相比明顯增多（P<0.01）。MC組與Res組組間比較，Res組TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較多，差異顯著（P<0.05）。對(duì)照組黑質(zhì)OX-42陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞大部分呈分枝狀，細(xì)胞體較小，突觸細(xì)長(zhǎng)。PD組黑質(zhì)OX-42陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞大部分呈圓形，突起少而短，甚至消失，呈“灌木樣”；少部分有短粗突觸，呈“阿米巴”狀。與PD組相比，Res

8、組和MC組呈激活狀態(tài)的OX-42陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。對(duì)照組黑質(zhì)僅見(jiàn)少數(shù)NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞，PD組黑質(zhì)NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞增多（P<0.01）。與PD組相比，Res組和MC組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。MC組與Res組組間相比，Res組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)更少，差異顯著（P<0.05）。Western blot分析表明對(duì)照組大鼠黑質(zhì)TH蛋白大量表達(dá)，僅有微量NF-κB P65蛋白表達(dá)，PD組TH蛋白表達(dá)減少，NF-

9、κB P65蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.01）。與PD組相比，Res組、MC組TH蛋白表達(dá)增加，NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.01）。MC組與Res組組間比較，Res組TH蛋白表達(dá)增加，NF-κB P65蛋白表達(dá)下降，差異顯著（P<0.05）。 結(jié)論：LPS可誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、NF-κB表達(dá)增加、使TH陽(yáng)性DA能神經(jīng)元數(shù)量減少，TH表達(dá)下降。中藥白藜蘆醇及第二代四環(huán)素類抗生素美滿霉素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活、抑