不同激活狀態(tài)巨噬細胞和BMP2在鼓室硬化發(fā)生機制中的作用研究.pdf

1、鼓室硬化的發(fā)病機制復雜，目前還存在爭論。雖然不同組織和器官硬化的病因、臨床表現(xiàn)和自然病程等方面有差別，但鼓室硬化與其他器官硬化在細胞水平和分子水平的纖維化形成過程是相似的。既往的研究已經(jīng)證明巨噬細胞是鼓室硬化的細胞基礎。然而，巨噬細胞參與鼓室硬化的分子機制及其信號通路尚不明料。骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein2，BMP2)是有效的骨生成誘導因子，參與鈣化、骨化過程；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxis

2、omeproliferators—activatedreceptorγ，PPARγ)通路參與器官纖維化、硬化的發(fā)生；以上兩者在巨噬細胞中均有發(fā)現(xiàn)。本研究設計將巨噬細胞株Ana-1和小鼠中耳黏膜成纖維細胞共培養(yǎng)，體外模擬中耳炎癥條件，通過檢測中耳黏膜成纖維細胞的增殖、BMP2基因表達以及PPAR—γ途徑的調(diào)控影響，揭示不同激活狀態(tài)巨噬細胞、BMP2以及PPAR—γ途徑在鼓室硬化中的作用，旨在探索鼓室硬化的發(fā)生機制，為鼓室硬化防治提供實驗依

3、據(jù)和研究線索。 本研究分為三章。 第1章巨噬細胞和BMP2在鼓室硬化黏膜組織中的定位和表達 目的:檢測巨噬細胞、BMP2在鼓室硬化的中耳黏膜中的定位和表達，探討巨噬細胞、BMP2在鼓室硬化發(fā)生機制中的作用。方法:選取17例鼓室硬化的病例，以及17例年齡、性別、病程相匹配的單純慢性化膿性中耳炎病例，應用免疫組化的方法檢測病變黏膜的巨噬細胞標志CD68、以及BMP2蛋白在兩組標本的定位和表達情況。結果:兩組中CD68

4、陽染細胞均主要分布于黏膜下層中，黏膜層中僅有少量分布。兩組中，陽性病例均為12例(12/17，70.59％)，兩組病例的CD68陽染細胞數(shù)量無差別(P=0.79)，鼓室硬化組為6.94±6.08，慢性化膿性中耳炎組為7.59±7.84。兩組均有BMP2陽染細胞表達，BMP2蛋白廣泛表達于中耳黏膜層、黏膜下層。兩組的BMP2陽染細胞數(shù)及平均光密度值均有顯著差異(p＜0.05)。在鼓室硬化組中，鈣化斑周圍有巨噬細胞浸潤和大量BMP2陽性著色

5、，鈣化斑周圍的部分細胞同時有CD68和BMP2陽性著色。結論:巨噬細胞參與了鼓室硬化，可能通過分泌BMP2在鼓室硬化形成中起重要作用。 第2章不同激活狀態(tài)巨噬細胞的BMP2基因和PPARγ基因表達及其相關性 目的:通過了解巨噬細胞在不同激活狀態(tài)下BMP2基因表達的變化以及與PPARγ基因表達的關系；并引入PPARγ配體羅格列酮，了解PPARγ活化與BMP2基因表達的關系；以探討不同激活狀態(tài)巨噬細胞的功能。方法:體外培養(yǎng)小

6、鼠巨噬細胞株Ana-1；用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和地塞米松(Dexamethasone，DEX)分別激活巨噬細胞，得到經(jīng)典激活巨噬細胞和選擇性激活巨噬細胞，運用酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(enzyme—linkedimmunosorbnentassay，ELISA)法和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(fluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainr

7、eaction，F(xiàn)Q—RT—PCR法)檢測不同激活狀態(tài)巨噬細胞的BMP2蛋白和基因表達，分析其相關性；再加入羅格列酮培養(yǎng)不同激活狀態(tài)的巨噬細胞，運用FQ—RT—PCR法檢測各組巨噬細胞的BMP2和PPAR—γ的基因表達。結果:不同激活狀態(tài)巨噬細胞Ana-1的BMP2的蛋白表達與其基因表達呈正相關。選擇性激活組巨噬細胞的BMP2蛋白表達和基因表達最高(p＜0.05)，另兩組間無顯著差異(p＞0.05)。激活組巨噬細胞的PPAR—γ表達雖然

8、較高，但與未激活組比較無顯著差異(p＞0.05)。隨著羅格列酮濃度增加，三組巨噬細胞的PPARγ基因表達均增高，兩激活組于10umol/L達到高峰(p＜0.05)，且選擇性激活的巨噬細胞表達最高(p＜0.05)；三組巨噬細胞的BMP2基因表達均顯著降低(p＜0.05)。結論:選擇性激活的巨噬細胞分泌更多BMP2，后者可能在硬化斑形成中發(fā)揮主要作用，可以通過活化PPARγ通路來減弱巨噬細胞的BMP2表達。 第3章不同激活狀態(tài)巨噬細

9、胞對小鼠中耳粘膜成纖維細胞增殖和分泌BMP2的影響 目的:通過小鼠中耳成纖維細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，檢測中耳成纖維細胞的增殖情況與BMP2、PPARγ基因表達的關系，探討PPARγ通路在防治鼓室硬化的可行性。方法:在與不同激活狀態(tài)巨噬細胞共培養(yǎng)的中耳成纖維細胞中加入PPARγ特異性配體羅格列酮，運用FQ—RT—PCR法檢測各組的BMP2和PPAR—γ的基因表達。并采用細胞計數(shù)試劑盒(CCK—8試劑盒)檢測各種濃度羅格列酮影響下巨噬

10、細胞株Ana-1、小鼠中耳成纖維細胞的增殖情況以及與不同激活狀態(tài)巨噬細胞共培養(yǎng)條件下中耳成纖維細胞的增殖情況。結果:中耳成纖維細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)后，尤其是與激活的巨噬細胞共培養(yǎng)后，中耳成纖維細胞的BMP2mRNA表達升高。在與激活狀態(tài)巨噬細胞共培養(yǎng)條件下，中耳成纖維細胞的BMP2mRNA表達和PPARγmRNA表達呈顯負相關(r=—0.507p=0.035)。隨著羅格列酮濃度增加，四組中耳成纖維細胞PPARγmRNA的表達均升高，10

11、umol/L為最有效濃度，經(jīng)典激活巨噬細胞共培養(yǎng)組的PPARγmRNA表達始終最高；相反，四組中耳成纖維細胞BMP2mRNA的表達均降低，10umol/L為最有效濃度，選擇性激活巨噬細胞共培養(yǎng)組的BMP2mRNA表達始終最高。各種濃度羅格列酮對巨噬細胞株Ana-1、小鼠中耳成纖維細胞的增殖無影響(p>0.05)，與不同激活狀態(tài)巨噬細胞共培養(yǎng)條件下的各組中耳成纖維細胞增殖無顯著差別(p>0.05)。結論:不同激活狀態(tài)巨噬細胞會影響中耳成纖