TAK1在糖尿病腎病巨噬細(xì)胞激活中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭（end-stage renal failure,ESRF）的主要病因，如何早期有效防治DN已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外學(xué)者密切關(guān)注的課題。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，晚近研究認(rèn)為除代謝與血流動(dòng)力學(xué)紊亂外，以巨噬細(xì)胞激活介導(dǎo)的腎內(nèi)炎癥在 DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但糖尿病腎內(nèi)巨噬細(xì)胞激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。
　　轉(zhuǎn)

2、化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(TGF-βactivated kinase1,TAK1)是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的成員之一，在功能上位于絲裂原蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶的上游。近來(lái)研究表明TAK1可以被多種刺激因素激活并活化MAPK通路，且活化的TAK1可磷酸化并激活NIK(NF-κBinduced kinase)，最后激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及控制各種基因如炎癥因子、細(xì)胞粘附分子及生

3、長(zhǎng)因子等表達(dá)中發(fā)揮重要的作用。本研究采用TAK1抑制劑(5Z-7-oxozeaenol，OZ)分別作用于糖尿病db/db小鼠和小鼠巨噬細(xì)胞，從整體、細(xì)胞和分子水平系統(tǒng)觀(guān)察 TAK1信號(hào)通路、炎癥因子、趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)變化，探討TAK1參與早期DN發(fā)生的作用機(jī)制

4、。從基因或蛋白水平阻斷TAK1致病作用的有效途徑，進(jìn)一步闡明DN發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制并為其防治提供新思路。
　　方法：
　　第一部分：健康雄性小鼠36只，選取同窩野生型小鼠(wild type,WT)12只作為正常對(duì)照組(WT，n=12)，db/db小鼠(db/db，n=12)和db/db小鼠+抑制劑組(db/db+OZ，n=12)。其中db/db小鼠尾尖取血血糖儀測(cè)定血糖，血糖≥16.7mmol/L者確定為模型。于用藥第8，1

5、2周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本，測(cè)定血糖、體重、腎重以及24h尿白蛋白排泄率；光鏡、電鏡觀(guān)察腎組織病理改變；免疫組化檢測(cè)ED-1,NF-κBp65,MCP-1以及TNF-α；western blot檢測(cè)腎組織p-TAK1,TAB1，p-p38MAPK以及IL-1β蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)趨化因子ICAM-1，MCP-1 mRNA的表達(dá)。
　　第二部分：取小鼠巨噬細(xì)胞種植于96孔板，采用CCK-8法分別檢測(cè)干預(yù)藥物TAK

6、1抑制劑在不同藥物濃度對(duì)高糖、AGEs培養(yǎng)巨噬細(xì)胞活力的影響。采用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞分組：甘露醇對(duì)照組(MN)，牛血清白蛋白組(BSA)，正常對(duì)照組(NC)，高糖組(HG)，AGEs組(AGEs)，高糖+TAK1抑制劑組(HG+OZ30,100,300nM)，AGEs+TAK1抑制劑組(AGEs+OZ30,100,300nM)，于刺激的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖、AGEs刺激因素對(duì)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的激活作用；提取細(xì)胞mR

7、NA及細(xì)胞總蛋白，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中促炎細(xì)胞因MCP-1以及TNF-αmRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)各組總蛋白中p-TAK1，TAB1，p-JNK，p-p38MAPK，NF-κB p65，IL-1β蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：①與對(duì)照組相比，8-12周db/db小鼠血糖、體重、腎重及24h尿白蛋白排泄率均明顯升高(P<0.01)；db/db+OZ組小鼠體重、腎重及24h尿白蛋白排泄率改

8、變較db/db小鼠顯著減輕(P<0.05，P<0.01)。②8-12周時(shí)，光鏡觀(guān)察db/db小鼠腎小球體積增大、系膜細(xì)胞增多、基底膜增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)增多，電鏡觀(guān)察db/db小鼠腎小球基底膜局部隆起不規(guī)則增厚，足細(xì)胞足突融合；db/db+OZ組腎組織的病理改變則明顯得到改善(P<0.05)。③免疫組化結(jié)果顯示，8-12周db/db小鼠較對(duì)照組ED-1，NF-κB p65，MCP-1和TNF-α蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；db/d

9、b+OZ組與 db/db組相比，ED-1，NF-κB p65，MCP-1和TNF-α蛋白的表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。④Western blot結(jié)果顯示，8-12周db/db小鼠較對(duì)照組p-TAK1,TAB1，p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；db/db+OZ組與db/db組相比，p-TAK1，TAB1，p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表達(dá)則明顯下降(P<0.05)；非磷酸化TAK1，p38MAP

10、K在各組的表達(dá)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。⑤實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，db/db小鼠較對(duì)照組小鼠趨化因子ICAM-1，MCP-1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；db/db+OZ組與 db/db組相比，ICAM-1，MCP-1 mRNA表達(dá)則明顯抑制(P<0.05，P<0.01)。
　　第二部分：①與正常對(duì)照相比，10,30,100和300 nmol/L抑制劑對(duì)HG,AGEs培養(yǎng)的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P>0.05

11、)，1000nmol/L抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞活力有影響(P<0.05)。②實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，HG，AGEs組細(xì)胞MCP-1，TNF-αmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；抑制劑組與HG，AGEs相比，MCP-1，TNF-αmRNA的表達(dá)則明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HG，AGEs刺激因素可成功誘導(dǎo)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞功能表型向M1型巨噬細(xì)胞活化；抑制劑干預(yù)使 M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)百

12、分比明顯降低(P<0.05，P<0.01)。④Western blot結(jié)果顯示p-TAK1,TAB1，p-JNK,p-p38MAPK,NF-κBp65和IL-1β蛋白在HG、AGEs組的表達(dá)強(qiáng)于NC（P<0.05）組；但抑制劑組蛋白表達(dá)明顯弱于HG，AGEs組(P<0.05)。TAK1，JNK,p38MAPK在各組的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，糖尿病狀態(tài)下p-TAK1在腎臟表達(dá)增強(qiáng)

13、，伴有腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、巨噬細(xì)胞活化等腎臟炎癥病理改變，提示 p-TAK1在糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制中可能起一定作用。
　　2、db/db小鼠腎組織 p-TAK1，TAB1，p-p38MAPK和NF-κB p65的表達(dá)上調(diào)及ICAM-1，MCP-1，TNF-α，IL-1β的合成增加，TAK1抑制劑可以下調(diào)MAPK，NF-κB信號(hào)通路以及炎癥因子的表達(dá)，提示 TAK1促發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制可能與MAPK以及NF-κB信