柑橘木虱對(duì)殺蟲劑敏感性檢測(cè)及抗藥性相關(guān)基因分析.pdf

1、柑橘木虱是柑橘毀滅性病害柑橘黃龍病的傳播媒介?；瘜W(xué)控制柑橘木虱是遏制柑橘黃龍病擴(kuò)散蔓延的有效途徑之一。然而，由于長期不合理的使用殺蟲劑使得柑橘木虱對(duì)一些常用殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。在中國、美國及全球其他柑橘產(chǎn)區(qū)均有柑橘木虱抗藥性的報(bào)道。因此，針對(duì)抗藥性的研究可為高效防控柑橘木虱指明方向。擬除蟲菊酯是一類作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的殺蟲劑，能有效控制衛(wèi)生害蟲以及農(nóng)業(yè)害蟲。該類殺蟲劑的作用靶標(biāo)為節(jié)肢動(dòng)物的鈉離子通道，是一種在興奮性細(xì)胞中起始并傳遞動(dòng)作電

2、位的跨膜蛋白。擬除蟲菊酯優(yōu)先與開放狀態(tài)的鈉離子通道結(jié)合并使通道張開的狀態(tài)延長，從而使昆蟲癱瘓并不久死亡。鈉離子通道的非同義突變會(huì)降低昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯的敏感性。同時(shí)，鈉離子通道可變外顯子的組合也會(huì)影響昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯的敏感性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究功能基因的一種方法，其已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。利用它高通量的特性，可以獲得研究所需要的重要的基因。據(jù)此，本學(xué)位論文以柑橘木虱為研究對(duì)象，在明確其田間種群對(duì)常用藥劑敏感性水平的基礎(chǔ)上，測(cè)定了寄主植物對(duì)其體內(nèi)

3、解毒代謝酶活性的影響，克隆獲得了柑橘木虱的鈉離子通道基因的序列并預(yù)測(cè)了與抗藥性有關(guān)的突變位點(diǎn)，系統(tǒng)分析了鈉離子通道基因可變外顯子的組合及其在不同生長發(fā)育階段的頻率，最后利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法挖掘出柑橘木虱與抗藥性相關(guān)基因，主要研究結(jié)果如下：
　　1美國佛羅里達(dá)州柑橘木虱對(duì)殺蟲劑敏感性檢測(cè)
　　采用生物測(cè)定的方法系統(tǒng)監(jiān)測(cè)了美國佛羅里達(dá)州5個(gè)縣的柑橘木虱田間種群對(duì)7種常用殺蟲劑的敏感性水平。結(jié)果表明，不同地區(qū)柑橘木虱對(duì)藥劑的敏感性差異

4、很大。Lake Alfred的柑橘木虱對(duì)甲氰菊酯的敏感性顯著低于Winter Garden的柑橘木虱。La Belle地區(qū)的柑橘木虱對(duì)西維因、樂果和噻蟲嗪的敏感性顯著低于Fort Pierce的柑橘木虱。Fort Pierce地區(qū)的柑橘木虱對(duì)吡蟲啉的敏感性顯著低于La Belle的柑橘木虱。Winter Garden地區(qū)柑橘木虱對(duì)噻蟲嗪的敏感性顯著低于Fort Pierce的柑橘木虱?？傮w來看，柑橘木虱對(duì)殺蟲劑敏感性下降說明這些地區(qū)柑橘

5、木虱有潛在發(fā)展為抗性的風(fēng)險(xiǎn)。
　　2寄主植物對(duì)柑橘木虱主要解毒代謝酶活性的影響
　　采用離體酶活性測(cè)定的方法，分析了柑橘木虱分別飼養(yǎng)于3種寄主植物12代后其體內(nèi)的酯酶（EST）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和P450的活性。結(jié)果表明，飼養(yǎng)于千里香上柑橘木虱的P450活性顯著高于飼養(yǎng)于夏橙和九里香上的柑橘木虱的P450活性，且后兩者之間沒有顯著差異。飼養(yǎng)于3種寄主植物上的柑橘木虱體內(nèi)的EST活性均沒有明顯差異。飼養(yǎng)于千里香和九

6、里香上的柑橘木虱體內(nèi)的GST活性顯著高于以夏橙為寄主飼養(yǎng)的柑橘木虱的GST活性，且前兩者之間無顯著性差異。測(cè)定柑橘木虱3個(gè)種群對(duì)甲氰菊酯的敏感性發(fā)現(xiàn)三者之間雖存在差異，但統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著，分析發(fā)現(xiàn)這種差異與酶活性的差異一致。因此，不同寄主植物可能影響柑橘木虱體內(nèi)的解毒代謝酶活性。
　　3柑橘木虱鈉離子通道的鑒定、分析及突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)
　　克隆獲得了柑橘木虱鈉離子通道基因的cDNA全長序列。結(jié)合生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確了

7、柑橘木虱的鈉離子通道基因的36個(gè)外顯子。依據(jù)密碼子使用規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，與昆蟲抗藥性相關(guān)的6個(gè)突變位點(diǎn)中，V410、M918和F1534是柑橘木虱最有可能發(fā)生突變的位點(diǎn)。同時(shí)在序列比對(duì)或克隆片段中鑒定出柑橘木虱鈉離子通道的可變外顯子j、i、a、b、f、k和l。
　　4柑橘木虱鈉離子通道基因可變外顯子的組合及其在不同生長發(fā)育階段的頻率
　　研究建立了一種新的可變外顯子在單分子中組合的探測(cè)方法，并將該方法命名為Variant-det

8、ecting PCR。利用該方法測(cè)定了柑橘木虱66個(gè)鈉離子通道單分子中可變外顯子的組合，發(fā)現(xiàn)了13種可變外顯子的組合。其中，可變外顯子j在卵中頻率最低，b在1齡幼蟲時(shí)頻率最高，可變外顯子f則從1齡到5齡若蟲的頻率逐漸降低。
　　5柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組組裝、基因功能注釋及抗藥性相關(guān)基因挖掘
　　對(duì)柑橘木虱4個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝，共成功組裝58,059條Unigene。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明，有20,191條Unigene得到功能

9、注釋。其中，與抗藥性相關(guān)的基因包括細(xì)胞色素P450基因序列49條、 NADH脫氫酶基因序列46條、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因序列16條、羧酸酯酶基因序列16條、鈣通道基因序列14條、過氧化氫酶基因序列9條、氯通道基因序列9條、GABA受體相關(guān)基因序列2條、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因序列84條和魚尼丁受體相關(guān)基因序列2條。
　　綜上所述，美國佛羅里達(dá)州柑橘木虱對(duì)殺蟲劑敏感性有不同程度的降低，存在抗性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，說明對(duì)柑橘木虱的管理需要實(shí)時(shí)監(jiān)

10、控其抗藥性水平，為科學(xué)用藥提供依據(jù)。柑橘木虱的寄主植物可能影響其體內(nèi)的解毒代謝酶進(jìn)而影響其對(duì)殺蟲劑的敏感性，因此柑橘木虱的抗藥性管理需要考慮寄主植物等因素。昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗藥性往往由鈉離子通道基因多個(gè)點(diǎn)突變引起，且這些突變有疊加效應(yīng)。如果在生物測(cè)定中未發(fā)現(xiàn)顯著的抗性，則可以通過檢測(cè)鈉離子通道的突變位點(diǎn)確定柑橘木虱是否對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑存在抗性的風(fēng)險(xiǎn)。柑橘木虱鈉離子通道的鑒定和突變位點(diǎn)的預(yù)測(cè)為今后在分子水平上快速檢測(cè)田間柑橘木虱抗