模擬微重力環(huán)境下層狀修復體體外構建骨軟骨復合物的實驗研究.pdf

1、關節(jié)軟骨損傷一直是骨科面臨的難題之一。關節(jié)軟骨本身缺乏營養(yǎng)血管，再生細胞和體液因子少，軟骨的細胞/基質比低，一旦關節(jié)軟骨損傷，其再生能力十分有限。此外，再生軟骨的生物化學和機械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕。組織工程修復軟骨手段的目的是將修復物質運送到受損部位并且固定于該位置以達到有效的修復。從研究結果來看，雖然研究者們應用了多種研究方法、生物材料、種子細胞和修復方法，但修復關節(jié)軟骨的長期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強

2、度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問題等難題[1-3]。 研究目的: 通過最近新興的模擬微重力技術，將軟骨組織工程中應用廣泛的膠原、殼聚糖與β-TCP有機復合，模仿體內關節(jié)軟骨的分層結構，構建層狀梯度復合材料，并將擴增的兔擴增的經成骨誘導的兔骨髓間充質干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）和關節(jié)軟骨細胞植入其中體外培養(yǎng)，觀察軟骨細胞在膠原/殼聚糖/β-磷酸三鈣層狀

3、梯度修復體中的黏附、增殖、生長情況及生物學性狀變化，以評價微重力培養(yǎng)方法在軟骨組織工程的實用性及該復合材料作為關節(jié)軟骨組織工程支架的可行性。 研究方法: 以細胞和支架材料為實驗對象，以普通培養(yǎng)和微重力培養(yǎng)分兩組對照。MTT實驗分組：7個時間組：1天、4天、7天、10天、13天、17天、19天；8個平行孔/組，兩培養(yǎng)組共112孔。 1.成骨細胞的誘導和軟骨細胞的培養(yǎng)：用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)新西蘭兔原代BMSCs，體

4、外擴增后進行成骨誘導，3周后檢測細胞堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)生成情況：取新西蘭幼兔的關節(jié)軟骨消化培養(yǎng)軟骨細胞體外培養(yǎng)擴增，取2、3代細胞行s-100細胞免疫化學染色。 2.種子細胞和材料復合：將誘導成功后的成骨細胞和前4代軟骨細胞作為種子細胞與修復體復合體外普通培養(yǎng)和旋轉培養(yǎng)儀模擬微重力培養(yǎng)，進行MTT檢測比較兩組細胞增殖情況并觀察模擬微重力對細胞的影響；培養(yǎng)3w后行掃描電鏡檢查觀察軟骨細胞在修復體材料內黏附生長情況；3w后，細胞

5、和材料復合物進行脫鈣、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，觀察成骨細胞和軟骨細胞的生物學性狀變化及模擬微重力對復合物的力學影響。 統(tǒng)計學分析：MTT實驗中，相同時間點兩組之間的比較用兩獨立樣本t檢驗；同組不同時間點比較采用完全隨機設計單因素方差分析（One-way ANOVA）；兩組整體之間比較采用重復測量數據的方差分析。α=0.05為統(tǒng)計學檢驗水準。 研究結果: 1.細胞形態(tài)

6、：初接種時BMSCs呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，24h后開始貼壁，細胞呈長梭形，少量多角形，約1周左右細胞鋪滿培養(yǎng)瓶。加入成骨誘導培養(yǎng)液后細胞生長相對緩慢，其形態(tài)發(fā)生了改變，細胞逐漸增大，進而出現重疊生長。2周后細胞間可見圓形或卵圓形的鈣化結節(jié)，結節(jié)周圍細胞呈放射狀分布。堿性磷酸酶染色陽性，Von Kossa法檢測出鈣化結節(jié)。體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中，5h后開始貼壁，細胞呈扁平狀，大多數三角形，少量多角形，約1周細胞鋪滿

7、培養(yǎng)瓶，呈“鋪路石”樣。第2、3代細胞S-100免疫細胞化學染色胞漿內呈陽性反應。 2.細胞/支架光鏡下觀察：細胞懸液滴加于經預濕處理的復合支架材料上，支架材料迅速膨脹，證明細胞擴散到支架內。接種24h后，倒置顯微鏡下見材料不透明，無法觀察其內細胞生長情況，但可見大量成骨細胞和軟骨細胞貼附在材料旁培養(yǎng)板內。 3.MTT檢測：種子細胞和材料復合后，除第1天兩組之間無顯著性差異外（P=0.878），其余時間點兩組之間有顯著性

8、差異（P<0.05），模擬微重力組明顯比培養(yǎng)板組細胞增殖力高。兩組之間整體比較也有統(tǒng)計學意義（P=0.000），證明模擬微重力對成骨細胞在修復體內的增殖比普通培養(yǎng)起到了更好的促進作用。 4.掃描電鏡：培養(yǎng)3w后，普通培養(yǎng)組軟骨細胞成團地吸附于支架表面，從切開的材料上可以觀察到有部分細胞吸附于空隙內，細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上；模擬微重力培養(yǎng)組中細胞在修復體上分布更加均勻，且其中心部位軟骨細胞數量明顯比普

9、通培養(yǎng)組多。 5.HE染色和免疫學檢測結果：3w后，HE染色顯示培養(yǎng)板組的細胞多聚集在修復體表面，細胞數量明顯多于修復體內部，而模擬微重力組材料表面和材料內部細胞數量相差不大，分布較均勻，修復體內部細胞數量明顯比普通培養(yǎng)組多。兩組免疫組織化學染色顯示：細胞團中有基質分泌，沉積于細胞周圍；含有β-TCP端Ⅰ型膠原免疫組織化學染色陽性，不含有β-TCPⅡ型膠原免疫組織化學染色示胞漿內呈陽性反應。免疫熒光染色檢測顯示同一層狀修復體上成

10、骨細胞和軟骨細胞同時增殖，無明顯分界。 結論: 1.成功培養(yǎng)出兔原代軟骨細胞和BMSCs，并成功誘導BMSCs為成骨細胞，為進一步的細胞和材料的接種提供了數量充足和生物學性能良好的種子細胞。 2.膠原/殼聚糖/β-TCP層狀梯度復合體模擬了正常關節(jié)軟骨分層結構，細胞相容性好，能提供細胞生長的三維環(huán)境。 3.軟骨細胞和成骨細胞聯合種植在同一修復體上，體外構建骨軟骨復合體，為進一步動物實驗提供的基礎。