離體條件下低氧環(huán)境對破骨細胞生成及功能影響的實驗研究.pdf

1、【研究背景】骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，致使骨強度降低、骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。目前全世界約有2億人患骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居常見病、多發(fā)病第七位。我國于1999年進入老齡化社會，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前已有八千八百萬名患者，預(yù)計到今年年底將超過一億。中國內(nèi)地總患病率為百分之十二點四，老年

2、人中患病比例超過一半以上，其中骨折發(fā)生率接近三分之一，骨質(zhì)疏松不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且可導致脊柱、四肢等部位的骨折。年齡越大，骨折的風險性越高，該病引起的致殘率、致死率較高。 我國西部省區(qū)地處高原，約占全國陸地面積的一半，人口4億多，占全國總?cè)丝诮种?。高原地區(qū)由于海拔高，空氣含氧量明顯低于平原，特殊的高原環(huán)境對骨代謝的影響的研究結(jié)果顯示：高原干燥、缺氧的環(huán)境對骨代謝有影響，平原人群到高原后不久會引起骨量丟失，在高原發(fā)生

3、骨折會引起延遲愈合甚至不愈合。與低海拔地區(qū)相比，高海拔地區(qū)骨吸收增加，骨量減少。 大量的研究表明表達于干細胞和成骨細胞表面的腫瘤壞死因子受體家族的NF-kB受體活化因子配體(Receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)和護骨素(osteoprotegerin，OPG)在破骨細胞分化調(diào)節(jié)中起著重要的作用，許多局部因子通過調(diào)控OPG、RANKL和NF-kB受體活化因子(Receptor acti

4、vator of NF-kB，RANK)之間的比例，介導破骨細胞生成并維持其功能。本研究從體外模擬低氧環(huán)境入手，探討不同低氧濃度對破骨細胞生成及骨吸收功能的影響，試圖從分子水平揭示低氧對破骨細胞分化的影響的可能機制，探討低氧引起骨量丟失的可能的分子機制。 【目的】通過在體外模擬不同海拔高度的低氧環(huán)境，觀察不同氧濃度在不同時間點對小鼠骨髓細胞向破骨細胞分化及骨吸收功能的影響。 【方法】取出生2天內(nèi)的新生小鼠，取其顱蓋骨用組

5、織塊法培養(yǎng)成骨細胞，純化后傳代。取6～9周齡小鼠骨髓細胞，用含I，25(OH)<,2>D<,3>(10<'-8>mol/L)、地塞米松(10<'-8>mol/L)分化培養(yǎng)基在模擬不同海拔高度的氧濃度中培養(yǎng)。骨髓細胞純化后加入第3～5代成骨細胞進行共培養(yǎng)，隨機分組，每組樣本數(shù)為4，選擇不同時間點進行下面的實驗，每項試驗重復3次。用TRIzol提取細胞總RNA，用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測OPG、RANK及RANKL mRNA的

6、表達；用Westernblotting檢測RANK蛋白的表達情況。缺氧48小時后用流式細胞儀檢測小鼠破骨細胞的細胞周期；用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色和在骨片上形成骨吸收陷窩作為破骨細胞分化成熟的標志，利用酶動力方法測定培養(yǎng)上清液中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性。將小鼠骨髓細胞接種到無菌骨片上，隨機放入不同氧濃度的低氧環(huán)境中進行培養(yǎng)，7天后取出，將骨片進

7、行甲苯胺藍染色，采用Olympus倒置光相差顯微鏡計數(shù)TRAP染色陽性多核細胞的數(shù)目；掃描電鏡掃描骨吸收陷窩，通過Leica Quantimet 500圖像分析儀處理不同低氧環(huán)境下破骨細胞所形成骨吸收陷窩數(shù)目及面積。 【結(jié)果】 1、氧濃度及缺氧時間對前破骨細胞上RANKmRNA和RANK蛋白的表達有顯著影響(P<0.01)。缺氧第1天，各低氧組與常氧組相比無明顯差異；缺氧第3天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表

8、達較常氧組增加(P<0.05)，但各低氧組之間無明顯差異；缺氧第5天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表達較常氧組顯著增加(P<0.01)，其中3％氧濃度時表達增加最明顯；缺氧第7天，各低氧組RANKmRNA和RANK蛋白的表達較常氧組顯著增加(P<0.01)，但與第5天相比，RANKmRNA和RANK蛋白的表達相對減弱。 2、氧濃度及缺氧時間對成骨細胞上RANKLmRNA的表達有顯著影響(P<0.01)。缺氧第1天，與

9、常氧組相比，各低氧組RANKLmRNA表達明顯增加(P<0.01)，但各低氧組之間無明顯差異；缺氧第3天，與常氧組相比，各低氧組RANKLmRNA的表達顯著增加，以3％氧濃度升高最顯著；在缺氧第5，7天，與常氧組相比，RANKLmRNA的表達明顯增加(P<0.01)，但與前三天相比，其表達較前減弱。 3、氧濃度及缺氧時間對成骨細胞上OPGmRNA的表達有顯著影響(P<0.01)。在缺氧第1天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA

10、表達明顯減低(P<0.01)，但各低氧組之間無明顯差異；在缺氧第3天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA表達明顯減低(P<0.01)，3％、1％氧濃度較6％氧濃度減低更明顯，但二者之間無明顯差異。在缺氧第5，7天，與常氧組相比，各低氧組OPGmRNA表達顯著減低，且各低氧組之間的差異顯著，以1％氧濃度減低最明顯。 4、隨著氧濃度降低，骨吸收陷窩數(shù)目由7.58±1.08個/骨片升至9.67±0.98，12.50±1.45，11.

11、00±0.85個/骨片(P<0.01)；骨吸收陷窩面積由341.86±195.46μm<'2>/個增至470.62±207.89，688.08±429.02，583.27±224.54 μm<'2>/個(P<0.01)；抗酒石酸酸性磷酸酶的酶活力由3.87±1.58IU/L升至4.99±0.25，7.40±0.53，6.1l±0.37IU/L(P<0.01)。 5、氧濃度對破骨細胞周期有影響。在G1期，常氧組與低氧組之間破骨細胞

12、細胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由81.13±1.31％減少到66.77±0.70％，73.60±0.76％和增加到84.87±1.60％；在G2期，常氧組與低氧組細胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由8.57±0.48％增加到13.13±3.18％，14.20±0.44％和11.10±3.08％；在S期，常氧組細胞數(shù)含量比有明顯差異(P<0.01)，由10.63±1.17％升至20.17±3.36％，12.20±0.33％

13、，1％氧濃度時降至6.56±0.39％。 6、隨著氧濃度的降低，200倍光鏡下觀察到的抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細胞的數(shù)目由3.30±0.45個/玻片增加到6.10±0.55，7.90±0.42，5.00±0.61個/玻片(P<0.01)。 【結(jié)論】 1、氧濃度及缺氧時間對小鼠破骨細胞生成有顯著影響。隨著氧濃度降低，前破骨細胞向破骨細胞分化明顯增加，與常氧組相比，破骨細胞核數(shù)增多，體積增大，以3％氧濃度增加最明顯；隨

14、著缺氧時間延長，破骨細胞生成逐漸增多，以缺氧第5天增加最明顯，以后隨著缺氧時間延長破骨細胞生成相對減弱。 2、氧濃度對小鼠破骨細胞骨吸收功能有顯著影響，隨著氧濃度降低，破骨細胞骨吸收功能逐漸增強，尤其在3％氧濃度時，破骨細胞骨吸收功能達到高峰，以后隨著氧濃度降低骨吸收功能相對減弱。 3、隨著氧濃度降低，RANKL基因的表達先增多后減弱，OPG基因的表達隨著氧濃度降低而降低，且呈時間依賴性，RANK基因的表達隨著氧濃度的降