咖啡酸對破骨細(xì)胞形成及分化的影響.pdf

1、目的：:利用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系及破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系,研究咖啡酸對體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞和破骨前驅(qū)細(xì)胞形成及分化的影響,為以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為主的骨吸收性疾病的預(yù)防和治療提供一種新制劑,為今后進(jìn)一步研究破骨細(xì)胞及相關(guān)疾病打下基礎(chǔ)。
　　 方法：:選用4周齡SD雄性大鼠(體重約80-120g),利用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系及破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系,在10-8Mol1α,25(OH)2D3和破骨細(xì)胞分化因子sRANKL存在下,進(jìn)行體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng),

2、觀察咖啡酸對破骨細(xì)胞和破骨前驅(qū)細(xì)胞形成及分化的影響。
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物添加
　　 1.1全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系
　　 取4周齡SD雄性大鼠一只(80-120g),用異氟烷麻醉后,在無菌條件下取其脛骨和股骨,去掉骨垢端暴露骨髓腔,然后用10ml無菌注射器抽取不含血清的α-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,制取全骨髓細(xì)胞,1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘后,棄去上清液,加入含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液20ml,充分吹打混勻后形成

3、單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù),算出細(xì)胞原液濃度,然后配制成濃度為2×106cells/ml的細(xì)胞懸液1ml,加入破骨細(xì)胞分化因子(sRANKL)和活化型雙羥維生素D3(1α,25(OH)2D3),使其終濃度分別為20ng/ml和10-8M/ml,將細(xì)胞播種于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入濃度為2×106cell s/ml的細(xì)胞懸液0.5ml(每孔1×106cells)。細(xì)胞播種后將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)過程中嚴(yán)格保

4、持培養(yǎng)箱內(nèi)無菌及飽和濕度,培養(yǎng)至第4天時(shí)更換培養(yǎng)液一次,共培養(yǎng)7天。
　　 1.2破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系
　　 全骨髓細(xì)胞制備后,離心濃縮為2ml,然后注入葡聚糖凝膠柱G10(Sephadex G10)中過濾,除去骨髓間質(zhì)細(xì)胞,搜集非附著性骨髓細(xì)胞10-12ml,計(jì)算細(xì)胞數(shù),然后配制濃度為2×106/ml的細(xì)胞懸液13ml,添加破骨細(xì)胞分化因子(sRANKL)和活化型雙羥維生素D3(1α,25(OH)2D3),使其終濃度分別

5、為20ng/ml和10-8M/ml,將細(xì)胞懸液播種于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液0.5ml(1×106cells)。然后將培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至第4天時(shí)更換培養(yǎng)液一次,共計(jì)培養(yǎng)7天。
　　 1.3藥物添加
　　 在播種有兩種細(xì)胞培養(yǎng)系細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中添加藥物咖啡酸,使其濃度分別為0,0.5,1,10,50,100ug/ml,共4行6列,每行6個(gè)濃度,每個(gè)濃度每列4孔(n=4)。第一列為對

6、照組。
　　 2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
　　 兩種細(xì)胞培養(yǎng)系培養(yǎng)至第7天后分別行TRAP染色,倒置光鏡下觀察,計(jì)算染色陽性細(xì)胞數(shù)。全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系計(jì)算3核以上染色陽性細(xì)胞數(shù)。觀察咖啡酸對破骨細(xì)胞及破骨前驅(qū)細(xì)胞的抑制作用。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)處理采用mean±SD檢驗(yàn)分析,采用Student’s t-tes對不同藥物濃度進(jìn)行相同處理,各組與對照

7、組之間相比較,觀察咖啡酸對破骨細(xì)胞形成及分化的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
　　 1.1全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系
　　 對全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系進(jìn)行TRAP染色后,可見到大量的成熟破骨細(xì)胞,其形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為:細(xì)胞體積大,呈橢圓形、條索狀、漏斗形、油煎蛋樣或不規(guī)則形。胞漿豐富呈紫紅色,伸出許多細(xì)長的偽足樣突起,胞核大,數(shù)目多達(dá)幾個(gè)甚至幾十個(gè),核仁清晰,胞漿內(nèi)可見空泡結(jié)構(gòu)。見圖(1-4)。
　

8、　 1.2破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系
　　 經(jīng)TRAP染色后,可見到大量破骨前驅(qū)細(xì)胞,其形態(tài)學(xué)特征與成熟破骨細(xì)胞相似,只是細(xì)胞體積較小,形態(tài)多樣,可呈四邊形、橢圓形、條索狀、類圓形和不規(guī)則形等。細(xì)胞核大多為單核,也可見到2核者,見圖(5,6)。
　　 2咖啡酸對破骨細(xì)胞形成的抑制
　　 在全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系中,0.5、1、10、50、100ug/ml組與對照組比較,TRAP染色陽性細(xì)胞(3核以上)數(shù)僅為對照組的60.30

9、％、27.27％、12.73％、4.85％,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,加藥組對破骨細(xì)胞的形成有抑制作用,當(dāng)藥物濃度為50ug/ml時(shí),與對照組相比對破骨細(xì)胞形成有顯著抑制(p<0.01)。見table1和直方圖1。
　　 在破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系中,0.5、1、10、50ug/ml組與對照組相比,TRAP染色陽性細(xì)胞(單核或2核)數(shù)僅為對照組的75.08％、38.65％、16.74％、7.53％,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,加藥組對破骨細(xì)胞的形成有抑制作用,