新型生物人工肝用肝細胞保存液的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 我國的肝移植數(shù)每年在700例以上,1年生存率超過50％,最長存活時間超過6年。但是我國重型肝炎患者多供器官缺乏,許多患者得不到及時的肝移植手術(shù)而喪失存活機會,同時有效的供體資源也未能充分利用。因此生物人工肝與肝細胞移植等細胞水平的新治療方法得到了研究與發(fā)展。肝細胞移植和生物人工肝支持在大量動物實驗和一些臨床實驗中獲得良好效果,成為有前途的肝病治療途徑。實際上,如果肝細胞移植及生物人工肝在臨床的大量運用,肝細胞的

2、需求量必將增加,同器官移植一樣面對的供者不足的情況也將要出現(xiàn)。若有一實用可靠的低溫儲存技術(shù),建立一個肝細胞庫,危重患者隨時都能得到大量高活率、有功能的肝細胞；肝細胞移植和生物人工肝技術(shù)就能普遍推廣。20世紀70年代以來多種器官及組織保存方法的研究從基礎(chǔ)理論、動物實驗到臨床應用都取得了重大的進展,對于器官保存中細胞和組織損傷的基本機制有了更為深入地了解,使得器官的有效保存時間明顯延長,諸如UW保存液、HTK液、Celsior液等保存液的開

3、發(fā)與應用,極大地促進了臨床移植工作的開展。我國最近10多年來器官移植工作得到了飛速發(fā)展,在器官保存過程中的損傷機制以及器官保存液方面的研究也有一定的突破。但是,由于依賴進口保存液、成本高昂、不易獲得,在一定程度上制約了我國器官移植的發(fā)展。這就迫切需要研制一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的低成本的新型生物人工肝用肝細胞保存液來適應生物人工肝的發(fā)展。
　　 新型生物人工肝用肝細胞保存液配方設(shè)計的特點
　　 在全面分析UW液和HTK液等多

4、種配方的基礎(chǔ)上,吸取國內(nèi)外器官保存液的優(yōu)點,遵循保存液配制的原則,Belzer等根據(jù)低溫下器官的各種病理生理特點,提出了一種有效的器官低溫保護液的成分,必須具備以下六個方面的特點:①減少因低溫導致的細胞水腫②防止細胞的酸化作用③防止灌洗過程中的細胞間隙的腫脹④防止氧自由基的損傷,尤其在再灌注過程中⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。結(jié)合器官保存領(lǐng)域的新進展,簡化改良上述兩種先進保存液的成分,降低其成本,經(jīng)過反復配制及驗證

5、而成。新型生物人工肝用肝細胞保存液以所含組分來源豐富,成本低,不同于既往細胞保存液,各組分有確定的成分及濃度,其主要由雙糖、多聚糖、多肽、金屬離子、磷酸根離子等組成,因不需要添加血清等其他異種抗原及有細胞毒性的二甲基亞砜,避免了被未知病毒污染的危險及引入異種抗原后的抗原抗體排斥反應。因而細胞在低溫保存后不用經(jīng)特殊處理即可以用于生物人工肝生物反應器,很好滿足了臨床生物人工肝要求肝細胞材料的供應快速、應急(ready—to-use)的要求。

6、
　　 該生物人工肝用肝細胞保存液含有的基本組分是能夠維持低溫狀態(tài)下肝細胞的活力和電解質(zhì)生理濃度,其所含的組分主要是能夠減輕細胞內(nèi)酸化,減輕氧自由基損傷、穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)、提高細胞能量、減少低溫導致的細胞水腫。在配方設(shè)計上,吸收了UW液、HTK液等保存液的優(yōu)點同時具備了自己明顯的特點:
　　 1.具有強大的緩沖能力。選取兩種緩沖對,HPO4/H2PO4及檸檬酸鹽(枸櫞酸鹽)兩種緩沖對,防止細胞在低溫狀態(tài)的酸化作用。

7、　　 2.選用非滲透性保護劑海藻糖(trehalose),起到穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,減輕低溫狀態(tài)下細胞水腫。
　　 3.添加了外源性三磷酸腺苷、氯化鎂作為再生高能磷酸化合物的底物,通過ATP-Mg2+為細胞提供能量。
　　 4.采用還原型谷胱甘肽及有萬能抗氧化劑之稱的α-硫辛酸作為抗氧化系統(tǒng)及抗凋亡系統(tǒng),防止或減輕細胞再灌注損傷,自由基對細胞的損傷。
　　 5.引入中藥的活性成分苦參堿,利用其抗氧化性,

8、增強保護作用。
　　 6.用羥乙基淀粉,提高膠體滲透壓的方法,減輕細胞水腫。
　　 研究目的:針對現(xiàn)有保存液的缺陷,研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的低成本的新型生物人工肝用肝細胞保存液,并通過與UW液的比較,初步探討其對于生物人工肝用肝細胞C3A細胞的保存效果,以及探索肝細胞保存的原理,延長肝細胞低溫保存的時限,為下一步過渡到臨床應用提供一定的理論和實驗依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.采用規(guī)范的制劑標準,按照配

9、方配制新型生物人工肝用肝細胞保存液,pH值調(diào)定為PH為7.2—7.4,滲透濃度滲透壓為305±10mmol/L。
　　 2.實驗分組
　　 Ⅰ組:即對照組,常規(guī)培養(yǎng)C3A細胞不經(jīng)低溫保存；按保護液不同分3組,Ⅱ組:乳酸鈉林格氏液(RL)；
　　 Ⅲ組:新型生物人工肝保存液(NBS)；Ⅳ組:UW液。
　　 3.肝細胞的低溫保存及復蘇:將培養(yǎng)傳代后C3A細胞經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液,以3×105

10、個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)48 h,允許細胞貼壁生長。將細胞培養(yǎng)液棄去,用預先冷卻至4℃的PBS漂洗細胞2次,分別加入2mL預先冷卻至4℃的各組保護液,封口膜封口保持氣密性,快速置于4℃冰箱中,保存24,48,72 h后,從4℃冰箱中取出快速置入37℃水浴鍋中水浴復溫5min,留取保存液上清待檢。
　　 4.研究內(nèi)容及檢測方法:各組保存液分別保存C3A細胞24h、48、72h后,分別觀察以下內(nèi)容:肝細胞存活率、光鏡形態(tài)學變

11、化、肝細胞酶學(ALIT、AST)、肝細胞中MDA含量、復蘇后肝細胞合成Alb、肝細胞凋亡。通過以上指標的比較,初步判定新型保存液對生物人工肝用肝細胞的保存效果。
　　 5.統(tǒng)計處理:全部采取SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間采用析因方差分析,當存在交互效應時采用分開各因素進行One-Way ANOVA單因素方差分析組間效應,單向方差分析采用LSD法,當總體方差不齊時采用Dunnett's T3法；P<0.05為有統(tǒng)計學差異

12、。
　　 研究結(jié)果:
　　 1低溫保存不同時間肝細胞形態(tài)學改變:隨著保存時間的延長,各組保存液兩組均不同程度出現(xiàn)肝細胞腫脹、空泡樣等肝細胞腫脹變圓。RL組肝細胞在保存24 h后即見細胞開始脫落壞死。NBS組及UW液組出現(xiàn)細胞間隙增寬,但細胞卻以皺縮為主。在光鏡觀察下NBS組與UW液組未見明顯區(qū)別。
　　 2.低溫保存后細胞存活率檢測:NBS組與UW液組肝細胞存活率低溫24h、48h無明顯差異,而保存72h后NBS

13、組保存液存活率低于UW液組。對照組RL組在保存24h后即見開始出現(xiàn)大片細胞壞死脫落,存活率明顯下降。
　　 3.肝細胞酶學變化:NBS組和UW液組肝細胞低溫保存后ALT、AST均見升高,在低溫保存復蘇24h后呈現(xiàn)出一個急劇升高的波峰,在經(jīng)換液處理后峰值明顯下降,隨著復蘇后的繼續(xù)培養(yǎng),各個保存時間中UW液組肝細胞的活力及細胞狀態(tài)均較優(yōu)于NBS組,細胞較早進入指數(shù)生長期并出現(xiàn)較早出現(xiàn)重疊生長。肝細胞酶學也出現(xiàn)相應的升高,但幅度較之低

14、溫保存后酶學升高明顯為小。
　　 4.復蘇后肝細胞合成 Alb:NBS組與UW液組在低溫保存24h、48h后復蘇再培養(yǎng)中白蛋白合成功能無顯著性差異,而隨著保存時間延長到72h后,UW液組肝細胞白蛋白合成功能明顯優(yōu)于NBS組。
　　 5.肝細胞凋亡:吖啶橙/碘化丙啶雙染結(jié)果可見,RL組在保存24 h后即見較多細胞凋亡,胞核固縮狀、呈增強的、明亮的綠色熒光,并隨著時間的延長,胞核呈固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu),甚至呈現(xiàn)出“黃”色。保存